糖調節受損大鼠認知障礙及腦組織NF-κBp65、TNF-α 的表達

董銀華，王洪新，陳澤峰，魏 佳，趙 嵐，李 強，范宏光

糖調節受損(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病前期糖調節失衡的一種表現，一般包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病是一個較早就被證實與認知功能障礙相關的因素［1］，然而糖耐量受損作為糖尿病前期的一個重要臨床階段，是否與認知功能障礙相關，至今尚無定論［2］。本研究通過建立糖調節受損大鼠模型，從炎癥機制角度探討糖調節受損與認知障礙的關系。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備 SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，體重180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2007-004，隨機分為對照組(NGT 組)和實驗組(IGR組)，每組25 只。兩組均適應性喂養1 w(不計入實驗周期)，NGT 組給予普通飼料;IGR 組給予高脂高糖飼料，自由進水，室溫18 ℃～22 ℃，飼養20 w。從第8 周開始，每2 w 取鼠尾靜脈血進行一次葡萄糖耐量實驗，空腹血糖6.2～7.5 mmol/L 或者餐后2 h 血糖7.9～10.4 mmol/L 的大鼠造模成功［3］。

1.2 行為學檢測 NGT 組和IGT 組分別于第5 周、第10 周、第15 周、第20 周，采用Morris 水迷宮試驗測定包括:適應性訓練、定位航行實驗、空間探索試驗測定大鼠學習記憶能力，評定認知功能。

1.3 腦組織NF-κBp65、TNF-α 免疫組織化學檢測 造模成功后，每組每個時間點隨機取5 只大鼠深度麻醉后，4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，以視交叉前緣作后作冠狀位切片，行4 μm 厚的連續切片，然后依次脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片經脫蠟、水化，分別滴加第一抗體NF-κB、TNF-α，并4 ℃過夜。滴加生物素標記體，37 ℃孵育30 min。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37 ℃孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復染。目鏡測微尺在200 倍視野下計數細胞，分別取大鼠腦組織連續切片10 片，每片選10 個陽性視野，計數網格中陽性細胞數，重復3 次，取其平均值。

1.4 腦組織NF-κB mRNA、TNF-α mRNA 原位雜交檢測 原位雜交寡核苷酸探針試劑盒購自武漢博士德公司，用生物素標記。切片透明脫水后用0.01 mmol/L PBS 沖洗，0.2 mmol/L 鹽酸室溫酸化10 min，再次0.01 mmol/L PBS 沖洗后以25 μg/ml 蛋白酶K73 ℃消化10 min，并以2.5 g/L 乙酸酐平衡后，浸入90%(體積分數)乙醇脫水。切片在空氣中干燥后，用2 μg/ml 的生物素標記寡核苷酸探針孵育組織(30 μl/切片)，42 ℃孵育過夜(對照:雜交反應液中不加探針，用有意義鏈作探針)。雜交后系列SSC 洗滌封閉，置0.3%(體積分數H2O230 min)，而后4 ℃抗生物素血清過夜，置試劑盒ABC 液室溫孵育2 h，DBA 室溫染色5 min，陽性反應呈棕褐色。

2 結果

2.1 糖耐量損害大鼠成模情況 高脂高糖飼料飼養10 w 大鼠成模率60%;飼養15 w 大鼠成模率100%，模型組死亡2 只，及時補充。

2.2 認知功能評定情況 第5 周IGR 組較NGT 組逃避潛伏期短，空間探索時間長，隨著飼養周期的延長，糖調節損害大鼠逐漸成模;第15 周IGR 組大鼠全部成模，IGR 大鼠較NGT 組大鼠逃避潛伏期延長，空間探索穿臺次數減少，實驗結果有統計學差異(P＜0.05);20 w 時IGR 組與NGT 組大鼠比較學習記憶能力顯著下降(P＜0.01)(見表1)。NGT 組內不同時間點比較無差別，IGR 組自10 w 以后逐漸下降，差別顯著(P＜0.01)。隨著飼養周期的延長，達到糖調節受損狀態，大鼠的學習記憶能力明顯降低。

2.3 大鼠腦 組織NF-κBp65、TNF-α 及NFκBp65mRNA、TNF-αmRNA 表達 NF-κBp65、TNF-α陽性表達為胞漿呈現棕黃色，強陽性時細胞核也出現棕黃色顆粒，胞核藍染。采用平均灰度值比較大鼠腦組織NF-κBp65 和TNF-α 蛋白及mRNA 陽性表達水平。在第5 周IGR 組與NGT 組兩因子表達無差異(P＞0.05);與NGT 組比較第10 周IGR 組NFκBp65 及mRNA 表達有差異(P＜0.05);第15 周、第20 周逐漸增高，組間差異有統計學意義;與NGT組比較第15 周IGR 組TNF-α 及TNF-α mRNA 表達有差異(P＜0.05);第20 周有顯著差異(P＜0.01)，具體結果(見表2～表5)。

2.4 NF-κBp65 及TNF-α 的表達水平與認知之間的關系 Pearson 直線相關回歸分析發現，IGR組大鼠學習記憶成績與NF-κBp65 陽性表達水平呈正相關(r=0.472，P＜0.05)，與TNF-α 陽性表達水平呈正相關(r=0.475，P＜0.05)，而NGT 組兩者無明顯相關性(r=0.260，P＞0.05)。

表1 兩組大鼠學習記憶能力(±s)

表1 兩組大鼠學習記憶能力(±s)

與NGT 組比較* P＜0.05，#P＜0.01;與NGT 組內比較▽P＞0.05;IGR 組10 w 以后比較△P＜0.01

表2 兩組大鼠不同時間點腦組織NF-κB 平均灰度值比較(±s)

表2 兩組大鼠不同時間點腦組織NF-κB 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α 平均灰度值比較(±s)

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表4 兩組大鼠不同時點腦組織NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比較(±s)

表4 兩組大鼠不同時點腦組織NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表5 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α mRNA 平均灰度值比較(±s)

表5 兩組大鼠不同時間點腦組織TNF-α mRNA 平均灰度值比較(±s)

與NGT 組比較* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

3 討論

糖調節受損(IGR)是糖尿病前期狀態，是糖尿病的高危人群。糖尿病是癡呆的高危因素已被公認。英國前瞻性糖尿病研究發現，新診斷的2 型糖尿病半數已有血管病變，提示血管病變可發生于糖尿病之前，即在IGR 階段已經有炎性反應的發生，且可能與血管性認知障礙有關［4］。有研究報道［5］在60 歲以上老年患者人群中正常范圍高血糖水平海馬與杏仁核萎縮明顯，認知功能減低明顯。這也提示在診斷糖尿病之前高血糖水平已經對腦組織造成損害，影響老年人的認知功能。近年研究發現較多的炎性因子在胰島素抵抗和IGR 的發生中具有重要作用，如C 反應蛋白、腫瘤壞死因子-α 等都與糖耐量損害有關［6］。

核轉錄因子NF-κB，在靜息狀態下以二聚體狀態在細胞漿內與IκB 結合，激活后與IκB 解離，NFκB 核因子定位序列暴露，NF-κB 進入細胞核內，以二聚體的形式起轉錄調節作用，從而誘導白細胞介素-1、細胞間粘附分子、腫瘤壞死因子(TNF-α)等的表達，白細胞在各種炎性介質的介導下，向血管內皮細胞移動、粘附并滲出，參與炎癥的的級聯反應，最終導致缺血性神經元的損傷，另外各項因子如腫瘤壞死因子、白介素的表達反過來進一步增加NF-κB從而進一步促進炎癥因子的表達，進一步加重炎癥反應，形成惡性循環［7～9］。

本研究發現造模成功，第15 周后認知功能評價，糖調節受損大鼠學習記憶、能力明顯遲滯于對照組大鼠，而且隨著時間的延長這種趨勢愈加明顯;同時研究發現糖調節受損大鼠腦組織第10 周開始NFκBp65 蛋白表達NF-κBp65 mRNA 的表達均高于正常對照組，TNF-α 蛋白表達和TNF-α mRNA 的表達第15 周開始表達明顯增高，兩組間差異均有統計學意義，而炎癥因子表達不同步的原因可能與上游NFκBp65 炎性激活的過程有關。Pearson 直線相關回歸分析糖調節受損大鼠認知功能與NF-κB、TNF-α 的陽性表達水平呈正相關。

因此本研究認為炎癥機制在認知障礙的發病過程中起著重要的作用，大鼠腦組織NF-κB 和TNF-α炎性因子，參與了大鼠認知功能障礙形成的過程。

綜上，糖耐量受損大鼠腦組織炎性因子NF-κB、TNF-α 的表達明顯高于對照組，且與大鼠認知功能障礙明顯相關，本研究從炎癥角度探討了糖調節受損對大鼠認知功能障礙的影響，認為炎癥機制是糖調節受損認知功能障礙的重要機制，抗炎治療可能是防治糖調節受損認知功能障礙的重要靶點。

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［3］王 竹，楊月欣，向雪松，等.實驗大鼠血糖正常范圍的估算［J］.衛生研究，2010，39(2):133-142.

［4］Debeng D，Amelang M，Hasselbach P，et al.Diabetes and cognitive function in a population-based study of elderly women and men［J］.J Diabetes Complications，2006，20(4):238-245.

［5］Lucia Kerti，Veronica Witte，Angela Winkler，et al.Higher glucose levels associated with lower memory and reducedhippocampal microstructure［J］.Neurology，2013，81:1746-1752.

［6］Griffin WS.Inflammation and neurodegenerative disease［J］.Am J Clin Nutr，2006，83(Suppl):470-474.

［7］Cora H，Nijboer，Cobi J，et al.A dual role of the NF-kappa B pathway in neonatal hypoxic-ischemic brain damage［J］.Stroke，2008，39:2578-2586.

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