EPO 對Alzheimer 樣大鼠記憶能力及海馬synapsin1 蛋白表達的影響

李宜培，劉 芳，尚俊杰，靳 力，王 黎

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆最常見的類型［1］，其主要病理學特征為神經細胞外以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積為主的老年斑(senile plaque，SP)、以神經細胞內異常磷酸化的tau 蛋白聚集為核心構成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)以及皮質、海馬選擇性的神經元變性和缺失［2］。Aβ 作為老年斑的主要組成成分，被認為是導致神經元損傷和認知功能障礙的主要原因［3］。近年來的實驗表明，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)作為一種保護性細胞因子，在各種腦損害中發揮著重要的神經保護作用［4］。為探討EPO 在AD 治療中的潛力，本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態Aβ1-40的方法復制AD 動物模型［5］，通過腹腔注射重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHu-EPO)，觀察了EPO 對AD 大鼠記憶能力和海馬超微結構的影響，檢測海馬突觸蛋白1(synapsin 1，SYP1)蛋白的表達，并初步探討了其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性2 月齡Wistar 大鼠55只，清潔級，體質量250～300 g，動物批號:SCXK(豫)2005-2001，由河南省實驗動物中心提供。Y 迷宮法篩選后48 只大鼠隨機分為4 組:正常對照組、生理鹽水組(normal sodium，NS)、模型組、EPO 治療組，每組12 只。動物自由飲食，晝夜交替飼養，飼養室溫度保持為15 ℃～20 ℃。

1.2 主要試劑和實驗儀器 Aβ1-40(美國Sigma 公司);rHu-EPO(上海克隆生物高技術有限公司);多聚甲醛(美國BBI 試劑公司);兔抗synapsin1多克隆抗體，兔抗β-actin 多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Santa Cruz 公司);動物組織總蛋白抽提試劑，ECL 化學發光試劑盒(美國Pierce公司);顯影定影試劑盒(武漢博士德公司)。Y-迷宮(MG-3 型)(張家港生物醫學儀器廠)，腦立體定位儀(ZH-藍星B)(安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司)，透射電子顯微鏡(荷蘭FEI TecnaiG)。

2 實驗方法及步驟

2.1 Aβ1-40孵育 1 mg Aβ1-40溶于500 μl PBS 中，稀釋為濃度2 μg/μl，置于37 ℃恒溫箱中連續孵育12 d，蛋白充分伸展形成聚合態后4 ℃保存。

2.2 術前訓練 48 只大鼠每天上午固定時間Y 迷宮訓練，每天20 次，連續5 d，每只大鼠都達到學會標準，即連續9 次在60 s 內一次到達安全區。電刺激參數:電壓50～70 V，延時5 s［6］。

2.3 大鼠模型的建立 6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)后固定于腦立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［7］進行定位。使用微量進樣器施行海馬注射，每側海馬注射5 μl。NS 組按照造模方法海馬注射NS 5 μl，正常對照組大鼠不做處理。EPO 治療組大鼠在正常喂養的基礎上從造模手術當天開始腹腔注射5000 IU/kg rHu-EPO，隔天一次，共5 次。

2.4 Y 迷宮行為學測試 手術后第10 天各組大鼠進行行為學測試。按照術前訓練中的學會標準，記錄各組中每只大鼠錯誤次數、嘗試次數和全天總反應時間。

2.5 海馬電鏡標本的制作及觀察 造模手術后第10 天，Y 迷宮測試完畢后，每組隨機抽取2 只用于透射電子顯微鏡取材。大鼠麻醉、灌注后切取海馬CA1區組織塊約1 mm3。包埋后，荷蘭FEI TECNAIG 透射式電鏡下觀察并照像。

2.6 Western blot 蛋白印跡實驗 造模手術后第10 天，Y 迷宮測試后，每組中隨機選取6 只大鼠，麻醉后斷頭，取出腦組織，冰上剝離海馬，稱重。應用Western blot 檢測SYP1 蛋白的表達。

3 結果

3.1 空間記憶能力的改變 與NS 組相比，模型組大鼠錯誤次數、嘗試次數和全天總反應時間增加而EPO 組大鼠空間記憶能力提高，差異有統計學意義(P＜0.05)。EPO 治療組大鼠錯誤次數、嘗試次數和全天總反應時間均減少，與模型組比較差異有統計學意義(見表1)。

3.2 EPO 對大鼠海馬超微結構的影響 正常對照組和NS 組:電鏡下可見海馬神經突觸前后膜均一，厚度適中;突觸前膜內的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態正常，線粒體膜、嵴完整，內嵴清晰可見，基質均勻，粗面內質網散在分布，表面游離核蛋白體較多。模型組大鼠電鏡下神經細胞形態破壞，結構紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊。EPO 治療組大鼠神經元結構基本正常，突觸前膜內突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴清晰可見。

3.3 Western blot 蛋白印跡實驗 各組海馬組織中均可見SYPl 蛋白表達。與模型組相比，EPO 組SYPl 蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P ﹤0.05)。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較(n=12)

4 討論

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是刺激紅細胞合成的細胞因子，是組織氧合狀態的一種主要決定因素，目前臨床上多用于貧血的治療。許多研究表明EPO 作為一種近年來發現的新型神經元保護因子可以提高腎性貧血患者的認知能力［8］，可以明顯抑制缺血缺氧性腦損傷中神經元的凋亡［9］，也可以通過抑制Aβ25-35引起cleaved caspase-3 表達增高而對其誘導的細胞凋亡發揮保護作用［10，11］。本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態Aβ1-40的方法，成功建立公認的急性Alzheimer 樣大鼠模型，觀察了EPO 對AD 大鼠記憶能力和海馬超微結構的影響，檢測SYP1 蛋白的表達。

線粒體是存在于真核生物細胞質中、含有核外遺傳物質的細胞器，是細胞能力的化工廠。已有研究表明，AD 的發生與線粒體的結構和功能障礙密切相關［12～15］。突觸是神經元之間一種特化的細胞連接，是神經元信號傳遞的重要結構，通過它的傳遞作用實現細胞之間的通訊。大量實驗表明，學習記憶與中樞神經系統突觸的結構和功能的可塑性密切相關。突觸結構的破壞會中斷腦內很多功能通路中的聯系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴重的是認知和記憶障礙。本實驗中EPO 提高AD 大鼠空間記憶能力，減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕AD大鼠的海馬超微結構損傷程度，減輕其功能的喪失，進而改善AD 大鼠的認知功能障礙。

SYPl 是一種神經元特異的磷蛋白，該蛋白的表達在海馬結構形成及功能可塑中發揮一定作用，在突觸發生、突觸囊泡運輸及神經遞質釋放過程中也有重要的調節作用［16，17］。本實驗發現，模型組大鼠海馬組織中由于Aβ1-40對神經元的毒性作用，間接抑制了SYP1 蛋白的表達，而EPO 治療組大鼠與模型組相比SYP1 蛋白表達明顯增加，說明EPO 能夠拮抗Aβ1-40對神經元毒性作用，增加SYPl 蛋白的表達，導致遞質釋放增加和突觸傳遞能力提高，這可能是EPO 改善AD 大鼠空間記憶能力的另一個機制。另外，與NS 組相比，EPO 治療組大鼠SYPl 蛋白表達增加，這提示EPO 對正常大鼠可能也有促進SYPl 蛋白表達的作用。

綜上所述，EPO 可以改善大鼠由Aβ1-40引起的學習記憶障礙，提高空間記憶能力，這可能與減輕大鼠海馬組織超微結構破壞、減輕其功能的喪失、增加SYPl 蛋白表達發生有關，其深層機制仍有待進一步探索。

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