可樂定對永久性腦梗死大鼠的神經保護作用及對神經干細胞增生的影響

朱 琳，李建成，馬東明，姜正林，李永財，何 鵬，許世輝

α2 腎上腺素受體激動劑可樂定臨床上作為中樞性降壓藥使用。一些研究表明，α2 受體激動劑能拮抗低氧、腦缺血、興奮性毒性引起的腦損傷，縮小腦梗死體積，能通過延長抽搐和死亡的潛伏期達到拮抗嚴重的急性缺氧引起的腦損傷［1～3］。若使用α2-受體阻滯劑，則會增加重型缺氧的早產胎羊的神經元損傷［1］。Dean 等利用早產胎羊臍帶阻斷缺血模型的研究顯示，可樂定(10 μg/kg/h)治療可以增加存活的神經細胞數［1］。Hang 發現腦缺血前6～24 h給予可樂定(40 μg/kg)預處理，可改善神經功能評分并減少梗死范圍，而同時使用α2 受體阻滯劑拮抗可樂定的這一神經保護作用［2］。葉春玲等研究表明，可樂定可提高小鼠和貓腦缺血缺氧后的動物存活率和腦電活動［3］。

因此，本研究通過制備大鼠永久性腦梗死模型(permanent middle cerebral artery occlusion，PMCAO)，使用可樂定治療，觀察大鼠神經功能恢復情況，測量腦梗死體積，尼氏染色后進行神經細胞計數，BrdU-nestin 免疫熒光雙標檢測增生的神經干細胞數目以及采用ELISA 方法檢測神經再生相關因子在腦組織中的表達，進一步探討可樂定的神經保護作用，并觀察其對神經干細胞增生的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1 動物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠120只，SPF 級，體重260～280 g，由南通大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(蘇)2008-0010。

1.2 動物分組及藥物使用 大鼠采用隨機數字表隨機分組。于術后3 h 開始腹腔注射給藥，每24 h 一次，連續使用5 d，或至實驗終點。缺血對照組給予等劑量的生理鹽水(1 ml/kg)，假手術組不注射藥物或生理鹽水。實驗過程中，大鼠因麻醉意外、缺血損傷等原因死亡16 只，其實驗數據未納入統計。各處理組大鼠死亡率無顯著差異。實驗分組情況，神經行為與細胞計數實驗:假手術組(8 只)、缺血對照組(10 只，死亡2 只)、可樂定治療50 μg/kg組(10 只，死亡2 只)、可樂定治療100 μg/kg 組(10只，死亡2 只);梗死體積測定:假手術組(9 只)、缺血對照組(11 只，死亡2 只)、可樂定治療50 μg/kg組(11 只，死亡2 只);神經再生相關因子測定:假手術組(6 只)、缺血對照組(7 只，死亡1 只)、可樂定治療50 μg/kg 組(7 只，死亡1 只);干細胞增生檢測:假手術組(9 只)、缺血對照組(11 只，死亡2只)、可樂定治療50 μg/kg 組(11 只，死亡2 只)。

1.3 試劑及儀器 可樂定、氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma 公司，尼龍栓線(北京生物沙東生物技術有限公司)，動物恒溫手術臺(MA22 蘇州市蘇杭實驗動物設備廠)，冰凍切片機(Laica CM1900，德國)，數碼相機(Cannon Powershot S60，日本)，大鼠NGF、NCAM-L1、TN-C、GDNF、Nogo-A 的ELISA檢測試劑盒(上海繼錦化學科技有限公司)，熒光顯微鏡(Leica 319861，DM4000B)，酶標儀(Elx-800，美國 Bio-TEK 公 司)，5-Bromo-2 ’-Deoxy Uridine(B5002，Sigma)，Anti-nestin antibody produced in rabbit(N5413，Sigma)，Fluorescein(FITC)-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse IgG(Jackson)，Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat(Sigma)。

1.4 缺血模型制備 參照Lorenz(2009)改良方法，采用線栓法制作PMCAO 模型。予10%水合氯醛(0.35 g/kg，i.p)麻醉大鼠后，取頸部正中線切開，分離大鼠右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，用0 號縫合線結扎CCA近心端及ECA 起始部，夾閉ICA，在CCA 上作一小切口，栓線(直徑0.18 mm)從CCA 插入ICA，深度距ECA 分叉處為(18.5±0.5)mm，有阻擋感，此時栓線即穿過MCA 起始段并達到大腦前動脈(ACA)近端。固定栓線并結扎，縫合皮膚。假手術組栓線插入深度為1 cm，其余步驟同前。動物蘇醒后缺血對側肢體痛覺刺激缺失及運動障礙視為模型成功。

1.5 神經行為學評分 參照MNSS(modified neurological severity scores)18 分制評分法綜合性評分，反映大鼠運動、感覺、反射及平衡功能。13～18分提示嚴重損害;7～12 分提示中度損害;1～6 分提示輕度損害，正常動物為0 分。在術前及術后1、2、3、4、5 d 分別對各組動物采用盲法進行行為學檢測。

1.6 尼氏染色與神經細胞計數 大鼠術后5 d，深度麻醉下暴露心臟，穿刺針經心尖部刺入左心室至主動脈根部，固定，剪破右心耳，血液流出，先用350 ml 生理鹽水快速沖洗，后用4 ℃的4%多聚甲醛灌注，取腦，多聚甲醛中固定24 h，先后在20%、30%的蔗糖溶液中脫水，切片，尼氏染色，取缺血側前囟后1.7 mm～2.3 mm 海馬CA1區、CA3區、皮質區，高倍鏡(×400 倍)下計算各區完整的錐體細胞數，每張切片計數3 個區域，連續取7 張腦片，取平均數為該腦梗死側CA1區、CA3區、皮質區的存活細胞數。

1.7 腦梗死體積測量 術后3 d，深度麻醉大鼠，斷頭取腦，去除嗅球放入腦槽，-20 ℃冷凍10 min。從額極到枕極作額狀切片，厚度2 mm，腦片置于1%TTC 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，間隔10 min 翻動腦片。后置于4 %多聚甲醛緩沖液中固定，過夜。拍攝的圖像以Image pro plus(IPP)軟件處理，計算梗死面積(紅色為正常腦組織，白色為梗死區)，梗死體積(mm3)=非缺血側半球體積-缺血側半球未梗死區體積，腦梗死體積百分比(%)=梗死體積(mm3)/全腦體積(mm3)×100%。

1.8 神經再生相關因子檢測 大鼠于術后第6 天，深度麻醉下斷頭取損傷則腦組織，勻漿、提取蛋白，用BCA 法通過蛋白濃度測定試劑盒行蛋白定量。然后采用大鼠ELISA 試劑盒測定各神經再生相關因子(GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C)的濃度。取出板條復溫，先后加入標本、標準品、HRP 標記的檢測抗體，溫浴后徹底洗滌，用底物TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度，后以樣品濃度除以總蛋白濃度，最后得出單位總蛋白中所含樣品的量。

1.9 BrdU-nestin 免疫熒光雙標 于大鼠術后第3、4、5 天分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2’-DeoxyUridine，BrdU)溶 液(50 mg/kg，bid))。術后第6 天灌注、取材、固定、脫水、切片，后行BrdU-Nestin 免疫熒光雙標檢測。BrdU(1∶500，sigma);nestin(1∶100，sigma)。取缺血側海馬區前、中、后部共3 張腦片，用熒光顯微鏡采集圖片，拼合雙標圖片，高倍鏡(×200 倍)下計算皮質缺血損傷區周邊、海馬CA3區及海馬DG 區BrdU-nestin 雙標陽性細胞數，該大鼠缺血側該區域的細胞數為3張腦片的平均值。

1.10 統計學處理 用SPSS19.0 統計軟件分析處理數據，所有數據均用均數±標準差(±s)表示，神經功能缺損評分采用秩和檢驗;其余數據采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 可樂定減輕大鼠PMCAO 后的腦損傷。

2.1.1 神經行為學評分 假手術組神經功能正常，其神經行為學評分均為0 分，故表1 中未列出。腦缺血大鼠均有不同程度的神經功能缺損癥狀，其中缺血對照組最嚴重。與缺血對照組比較，術后第4 天、第5 天，可樂定50 μg/kg 治療組神經功能缺損癥狀明顯改善(P＜0.01 或P＜0.05)，100 μg/kg 治療組的作用略好于50 μg/kg 治療組，但兩者之間無統計學差異(見表1)。

2.1.2 神經細胞計數 大鼠PMCAO 后5 d，假手術組海馬組織無明顯損傷，CA1、CA3區錐體細胞層次清楚，結構完整，尼氏體豐富，細胞核大而圓，核仁明顯;皮質部位神經元形態正常，細胞排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰。缺血對照組缺血側海馬組織有明顯損傷，主要表現在CA1、CA3區大量錐體細胞缺失，殘存細胞排列紊亂，形態不規則，尼氏體減少或消失，胞核固縮，核仁欠清;缺血側皮質部著色明顯變淡，神經元縮小變形，核固縮，尼氏體消失?？蓸范?0 μg/kg 治療組和100 μg/kg 治療組海馬與皮質損傷減輕，表現為缺血側海馬錐體細胞排列較整齊緊密，胞核飽滿，核仁較清，CA1、CA3區錐體細胞缺失或胞核固縮較少;缺血側皮質部神經元形態基本完整，尼氏體豐富，胞核飽滿，核仁清晰。細胞計數顯示，與缺血對照組相比，可樂定治療組海馬CA1區錐體細胞數目增多(P＜0.05 或P＜0.01)，并且100 μg/kg 治療組多于50 μg/kg 治療組(P＜0.05，見表2);在海馬CA3區，可樂定50 μg/kg、100 μg/kg治療組錐體細胞數目也明顯多于缺血對照組(P＜0.01)，但兩個劑量組之間的差異無顯著性(見表2);皮質損傷灶周圍區域，可樂定治療組錐體細胞數目明顯增多(P＜0.01)，并且100 μg/kg治療組多于50 μg/kg 治療組(P＜0.01，見表2)。

2.1.3 梗死體積 術后3 d，TTC 染色紅色為非梗死區，白色為梗死區。梗死區與右側MCA 供血區一致。假手術組未見梗死灶(n=9)，缺血對照組有較大的梗死體積(29.80%±1.64%，n=9)，可樂定(50 μg/kg)治療組腦梗死體積為(19.15%±1.14%，n=9)，較缺血對照組明顯縮小(P＜0.01)。

2.2 可樂定促進大鼠PMCAO 后神經再生相關因子的表達 與假手術組相比，腦缺血損傷后第6 天，缺血對照組及可樂定(50 μg/kg)治療組大鼠損傷側腦組織中神經再生相關因子GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C 含量均顯著增加，與缺血對照組比較，可樂定組大鼠損傷側腦組織中上述因子的含量進一步增加，特別是Nogo-A 與TN-C 含量的增加有顯著性意義(P＜0.01 或P＜0.05，見表3)。

2.3 可樂定促進大鼠PMCAO 后神經干細胞的增生 腦缺血損傷后第6 天，在大鼠皮質缺血損傷區周邊可觀察到BrdU 和nestin 雙標陽性的細胞。BrdU 可摻入S 期細胞DNA，以此標記可觀察細胞增生，結合其它細胞標記物，雙重染色，可以反映增生細胞的種類。BrdU 和nestin 共標的細胞可認為是增生的神經干細胞。缺血對照組和可樂定(50 μg/kg)治療組皮質缺血損傷區周邊均可見增生的神經干細胞，分別為15.2±1.3 個(n=9)、22.3±0.3 個(n=9);假手術組為1.0±0.2 個(n=9)。與缺血對照組相比，可樂定組神經干細胞數目的增加更明顯(P＜0.01)。

表1 可樂定對大鼠神經行為學評分的影響(±s)

表1 可樂定對大鼠神經行為學評分的影響(±s)

與缺血對照組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 可樂定對海馬與皮質神經細胞計數的影響(±s)

表2 可樂定對海馬與皮質神經細胞計數的影響(±s)

與缺血對照組比較* P＜0.01;與可樂定50 μg/kg 組比較#P＜0.05，##P＜0.01

表3 可樂定對損傷側腦組織神經再生相關因子表達的影響(ng/ml，±s)

表3 可樂定對損傷側腦組織神經再生相關因子表達的影響(ng/ml，±s)

與假手術組比較* P＜0.01;與缺血對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

文獻報道可樂定具有神經保護作用，其機制可能與其抑制腦內去甲腎上腺素的釋放有關［1～3］。腦缺血后海馬和紋狀體等部位釋放的去甲腎上腺素會加重損傷，這與其增加神經元對谷氨酸的敏感性，加劇興奮性毒性有關。本研究發現可樂定治療可改善pMCAO 大鼠的神經功能缺損癥狀，減少缺血損傷后神經元的丟失，縮小梗死體積，與文獻報導相符。

此外，本研究發現可樂定治療能促進大鼠損傷側腦組織中神經再生相關因子-膠質細胞來源的神經營養因子(GDNF)、神經細胞粘附分子(NCAM)、神經生長因子(NGF)、髓鞘相關生長抑制因子(Nogo-A)、肌腱蛋白C(TN-C)的表達。文獻報道NGF在培養的皮質神經元中能抑制代謝性和興奮性毒性損傷［4］。長爪沙鼠腦缺血前后，腦室內注射NGF 可以減少海馬CA1區遲發性神經元死亡［5］。下調NCAM 導致MCAO 模型小鼠梗死體積增大，加劇神經元損害［6］。靜脈注射基因修飾的人骨髓間充質干細胞過表達GDNF，可減輕大鼠腦缺血后的神經功能缺損，縮小梗死體積［7］。在腦出血動物模型，GDNF有神經保護和促進功能恢復的作用［8］。Nogo-A 蛋白導入體外培養的大腦皮質神經元能拮抗外源性過氧化氫引起的氧化應激［9］。因此，本研究結果提示可樂定對腦缺血大鼠的神經保護作用可能與上調上述因子的表達、營養與保護神經細胞、減輕神經細胞損傷有一定的關系。

成年雄性猴注射NGF 能保護梗死皮質神經元，減少退變，促進神經芽生和突觸發生［10］。NCAM 可刺激軸突和樹突及其分支的生長，穩定突觸和促進記憶形成［11］，在神經系統發育、神經再生和突觸重塑中發揮重要作用。有文獻報道Nogo-A 能抑制軸突生長［12］，但也有人認為Nogo-A 不抑制軸突再生。例如，發育的神經元胞體和軸突表面、軸突的生長錐中均有Nogo-A 表達，但其并未抑制軸突生長，暗示它與軸突生長有關［13］。脊髓損傷后，GDNF 能防止運動神經元變性，促進軸突和髓鞘生長［14］。帕金森病基礎和臨床研究表明，紋狀體中注入GDNF 能阻止黑質多巴胺神經元退變，促進軸突生長。TN-C 對神經細胞的發育、功能形成和對皮質、海馬及小腦的神經可塑性有重要作用［15］。在體研究表明，TN-C 沿生長錐伸展分布，誘導軸突生長，可出現在順行性變性及損傷后再生的神經中。TN-C 還促進有絲分裂活動，外周神經自體移植入丘腦，神經內膜及施萬細胞髓鞘內再生的丘腦神經軸索表面可出現大量TNC。因此，可樂定通過增強上述神經再生相關因子的表達，可能會促進神經元突起的生長、突觸重塑，改善神經功能缺損癥狀。

NCAM 在細胞增生、遷移、軸突生長、突觸傳導和突觸可塑性中起重要作用［16］。神經系統中高表達的TN-C 可促進細胞增生、遷移和軸突生長、延長［17］。GDNF 能促進神經元的遷移和分化，與其引起分化相關的基因表達有關。在缺血缺氧新生大鼠模型中植入多能星形膠質干細胞，NGF、GDNF 能促進干細胞的遷移和分化［18］。Nogo-A 調節腦皮質神經元的放射狀遷移，Nogo-A 基因敲除小鼠的前腦神經前體細胞放射狀遷移受到干擾［19］。本研究發現可樂定治療組BrdU-nestin 共標的神經干細胞數目明顯增多，表明可樂定可能通過促進以上因子的表達，誘導神經干細胞的增生，繼而分化為具有功能的神經元，并遷移到相關功能區，修復損傷的腦組織及促進神經功能的進一步恢復，這為臨床應用可樂定治療缺血性卒中提供了重要的實驗依據。

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