腦梗死患者P2Y12 與CYP2C19 基因突變的臨床學特征及其與氯吡格雷動態抵抗的相關性

石紅婷，周伯榮，王 融，鄧燕華，關海濤，劉子凡

氯吡格雷［1］作為一種常見的抗血小板聚集藥，臨床試驗已經證明長期使用氯吡格雷能有效地減少嚴重不良心腦血管事件(major adverse cardiovascular and cerebrovascular events，MACCE)，然而，因為個體差異，有部分患者雖然長期規律服用氯吡格雷，但仍會出現心腦血管事件，這種現象稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)［2］。CR 發生率約16.8%～21%不等，在TIA 及卒中人群中可達到44%。我們近期研究結果［3］顯示，腦梗死患者CR 發生率為30.6%，與國內外文獻報道的CR 發生率(腦梗死人群)為28%～44%接近［3］。

腦梗死患者CR 發生率較高［4，5］。過去大部分的研究都集中在患者的CR 率。2013 年，我們的研究組首次報道的CR 動態特性的存在［4］。在本文中，我們分析了P2Y12 和CYP2C19 等位基因的臨床學特征，并觀察在腦梗死患者中P2Y12 與CYP2C19 基因突變與DCR 發生的相關性。我們希望指導臨床早期發現或預測個體將出現血小板抵抗現象。

1 材料和方法

1.1 研究設計 采用前瞻性、開放性、單盲研究，對入組的腦梗死患者按標準給予氯吡格雷(75 mg/d)，且繼續服用常規藥物，如降壓、降脂、降糖等，分別測定服藥前、服藥2 w、3 個月及6 個月后的PAR。根據服藥2 w 后的PAR，分為CR 組與NCR組，出現CR 的患者將換用或聯用其他抗血小板藥物(如阿司匹林、西洛他唑等)，并檢測其2 w 后的PAR 的變化，NCR 患者維持氯吡格雷(75 mg/d)治療，測定3 個月、6 個月后PAR，分為動態抵抗(DCR)組與持續非抵抗(CNCR)組。同時本研究按是否攜帶P2Y12εC，分為TT 組和C 組;按是否攜帶CYP2C19εA，分為GG 組和A 組;按共存基因，分為共存C 與A 組、共存T 與A 組、共存C 與G 組及共存T 與G 組。根據AHA/ASA(2011 年)發表的腦卒中二級預防指南，所有患者采用電話等方式囑患者繼續服藥。并要求患者按時到門診就診，測定相關實驗指標。

1.2 研究對象 連續性選取2011 年9 月～2012 年12 月在廣州醫科大學附屬第三醫院神經內科住院的首次或再次新發的急性腦梗死患者147例，腦梗死組納入標準:診斷符合世界衛生組織制定的標準［6］，經頭部計算機斷層掃描(computed tomography，CT)或3.0T 磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實。詳細的分組標準和排除標準見已發表的文獻［4］。本研究經過廣州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會批準，所有患者或其家人均簽署知情同意書。

1.3 血小板聚集率測定 按儀器相關要求［4］，使用的透光率集合度測定(light transmission aggregometry，LTA，CHRO-N02L0G Corporation，USA)血小板聚集功能。相關研究證實這種方法評估血小板聚集功能是臨床和研究中最常用的方法之一，并作為金標準［7］。CR 的判斷標準［8］，使用ADP 作為激動劑的血小板聚集抑制率，即氯吡格雷給藥后14 d血小板聚集比基線下降幅度≤10%稱為氯吡格雷抵抗(血小板聚集抑制率=治療前血小板聚集率-治療后血小板聚集率)，反之為氯吡格雷敏感。

1.4 危險因素評估 入院后記錄患者的性別、年齡、血壓，仔細詢問患者既往史、個人史、服藥史、家族史等。所有患者入院后當日行頭部CT 或MRI檢查，次日行血常規、凝血常規、生化常規、血脂常規、糖化血紅蛋白及血糖等檢查。

1.5 基因分析 分析患者P2Y12 與CYP2C19基因。采取德國QIAGEN 公司制備的基因組DNA試劑盒從全血中提取DNA。引物由寶生物(大連)有限公司合成。詳細分析基因的過程及基因圖片見已發表的文獻［4］。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0 軟件進行分析。計量資料用均數±標準差(±s)表示，數據不符合正態分布，用配對比較資料的秩和檢驗(Mannwhitney test)，計數資料用t 檢驗，對影響基因的臨床特征學多因素采用Logistic 回歸分析。基因型和等位基因頻率采用基因直接計數法計算，應用擬合優度檢驗計算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡(H-W 平衡);各組間基因型及等位基因頻率比較四格表χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料的比較 符合上述標準腦梗死患者共147 例，其中26 例(17.7%)因經濟負擔、外地定居及支架植入術需使用雙抗治療等退出本研究，包括6 例CR 患者及20 例NCR 患者，因此本實驗動態觀察121 例腦梗死患者。觀察結束，各組被完成的病例數分別為CR 組(36 例)、NCR 組(85 例)、DCR 組(15 例)、CNCR 組(70 例)。按等位基因分組分析，P2Y12 基因中TT 組與C 組比較及CYP2C19 基因中GG 組和A 組比較在性別、年齡、吸煙等入院時一般臨床特征上差異無顯著性(P＞0.05)(見表1)。

2.2 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因的臨床學特征分 析 LDL-C(OR=3.581，95% CI 2.070～6.195，P=0.000)為P2Y12εC 的臨床學因素(見表2);而甘油三脂(OR=2.812，95% CI 1.498～5.281，P=0.001)及糖化血紅蛋白(OR=2.327，95%CI 1.231～4.398，P=0.009)為CYP2Y19εA 的臨床學因素(見表3)。

2.3 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各組不同時間段血小板集率的比較 在P2Y12 組，C 組患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 個月后及6 個月后的PAR 與TT 組比較，差異無統計學意義(P＞0.05);而CYP2Y19 組，A 組患者在這4 個時間段與GG 組比較，A 組患者PAR 都較高，差異有統計學意義(P＜0.05，見表4)。共存C 與A 組患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后的PAR 高于共存T 與A、共存C 與G 及共存T 與G 者，差異有統計學意義(P＜0.05)，而3 個月后及6 個月后差異無統計學意義(P＞0.05，見表4)。

2.4 CR、NCR、DCR、CNCR 各組患者基因型和等位基因頻率的分布和分析 CR 及DCR 患者攜帶P2Y12 等位基因C 或T 與NCR 及CNCR 患者攜帶等位基因C 或T 頻率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。CR 及DCR 患者與NCR 及CNCR 患 者CYP2Y19εA 頻率比較差異有統計學意義(P＜0.05)，提示CYP2Y19εA 者CR 發生率高。CR 與DCR 患者比較，CYP2Y19εA 頻率比較無明顯差異(P＞0.05，見表5)。CR 及DCR 患者共存等位基因C 與A 頻率高于NCR 及CNCR 患者，差異有統計學意義(P＜0.05);而共存T 與A、共存C 與G 及共存T 與G 頻率差異無統計學意義(P＞0.05，見表5)。CR 與DCR 患者相比，共存等位基因C 與A 頻率無明顯差異(P＞0.05，見表5)。

表1 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因分組患者一般資料的比較

表2 P2Y12 等位基因C 的臨床特征學分析

表3 CYP2Y19 等位基因A 的臨床特征學分析

表4 P2Y12 和CYP2Y19 等位基因或共存基因各組不同時間段血小板集率的比較

表5 CR、NCR、DCR、CNCR 各組患者基因型和等位基因頻率的分析

3 討論

CR 受多方面因素影響，主要有基因多態性、個體差異、藥物的相互作用等［4，6，9，10］。其中基因多態性與CR 的關系成為當今預防治療的研究熱點，尤其P2Y12、CYP2C19 的基因多態性。最近相關研究顯示［11］P2Y12 及CYP2C19 受體的生理作用較為廣泛，影響著血栓形成的多個病理機制過程，如血小板聚集、血脂代謝等。其他相關研究顯示［12］，在腦梗死的二級預防中，抗血小板藥物的貢獻率僅次于降血壓的治療。

我們的研究顯示P2Y12εC 患者服用氯吡格雷前、服用2 w 后、3 m 及6 m 后的PAR 與P2Y12εT 比較，差異無統計學意義。據報道［13］P2Y12 基因的突變會降低氯吡格雷的反應，但并非所有研究已確認P2Y12 基因與CR 之間的關系［14］。本研究也發現，CR 及DCR 患者P2Y12εC 的頻率與NCR 及CNCR患者比較差異無統計學意義，且多態性基因型分布比較差異無統計學意義。單因素分析提示既往有DM、高LDL-C 及GHB 患者P2Y12 變異率較高，但多因素分析，僅LDL-C 為P2Y12εC 的臨床學特征。從以上研究分析，P2Y12 基因多態性可能與脂質代謝的調節密切相關，同時，可能由于存在其他的ADP受體參與氯吡格雷生理作用機制，因此，P2Y12 基因多態性與CR 之間的關系不顯著。

然而有趣的是CYP2Y19εA 患者在4 個時間段與CYP2Y19εG 患者比較，CYP2Y19εA 患者PAR 都較高，差異有統計學意義，表明CYP2Y19εA 與PAR有關，原因可能為此基因為代謝酶，其基因突變不僅會影響氯吡格雷的活性成分在體內的形成，還有可能降低降脂類、降壓類等多種藥物的代謝作用，從而增加血小板聚集，導致CR。CYP2C19 基因多態性已證實是CR 的一個獨立危險因素［8］。最近［15］也發現CYP2Y19εA 患者降低了抗血小板聚集的作用，且MACCE 發生率也明顯高于未攜帶者。同時相關研究顯示［16］攜帶有缺陷性CYP2C19 等位基因的患者表現出較低的氯吡格雷反應，證實CYP2C19 的突變與CR 有關。同樣，我們研究也顯示CYP2Y19 基因，CR 及DCR 患者比NCR 及CNCR 患者CYP2Y19εA頻率高，也就是說，CYP2Y19εA 者發生CR 或DCR風險較高。另外，本實驗還發現既往有DM、LDL-C、血糖濃度及GHB 患者CYP2Y19 變異率高，這些與國內外文獻報道基本一致［13］，而多因素分析顯示LDL-C 及GHB 為CYP2Y19εA 的臨床特征學因素，從而提示CYP2Y19εA 并具有高TG 及GHB 者，易發生CR 或DCR。

考慮單基因多態性對血小板功能的影響相對較弱。從而，共存兩種基因變異可能更易發生CR。近來研究［14］已證實共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 的患者與CR 相關。本研究首次評估共存基因多態性對腦梗死患者CR 和DCR 的影響，結果顯示，共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 者服用氯吡格雷前、服用2 w后的PAR 高于其它共存等位基因型，同時CR和DCR 患者共存等位基因C 與A 頻率分別高于NCR 和CNCR 患者，相關研究結果提示我們共存CYP2C19εA 與P2Y12εC 者易出現CR，這與既往的研究一致［14］。雖然這4 組之間比較，3 m 后及6 m后的PAR 無統計學意義，這種現象表明，相比DCR、CYP2C19εA 與CR 的更密切。另外，在本研究還顯示，DCR 與CR 比較，P2Y12εC、CYP2C19εA 的頻率以及共存C 與A 無明顯差異，而與NCR 或CNCR 比較，共存C 與A 者明顯增高，提示遺傳基因的因素在DCR 與CR 發生中的作用機制類似，且對DCR 的發生無特異性貢獻。本研究在隊列觀察研究曾報道，腦梗死患者CR 的獨立危險因素為糖尿病、TIA、高血壓病藥物使用、高膽固醇血癥等，而DCR 的獨立危險因素為高膽固醇血癥［4］，而脂質代謝紊亂和長期高血糖恰好是突變基因的臨床學特征。這些結果將為今后如何預防CR 和DCR 探索了新的思路，尤其對于DCR 的預防將可能更應該注重血糖和血脂代謝紊亂的調節治療。

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