利多卡因對肺缺血再灌注損傷模型大鼠炎癥反應因子的影響

倪程耀，陳 新，吳勝軍（浙江大學醫學院附屬第一醫院，杭州 310003）

肺缺血再灌注損傷（Lung ischemia reperfusion injury，LIRI）常發生在體外循環手術、肺移植、肺栓塞治療恢復血液供應后，是在缺血的基礎上機體繼發的再灌注損傷，會導致患者臨床癥狀不減輕反而加重的病理狀態，是危害患者恢復健康的重要障礙[1]。隨著人們對LIRI發病機制的深入研究，已應用多種藥物治療LIRI，并取得了良好的效果。利多卡因作為一種膜穩定劑，廣泛地應用于多種疾病的治療，現研究認為其能保護肺泡上皮細胞的功能，可減輕肺損傷[2]。因此本研究應用大鼠建立LIRI模型，體外給予利多卡因干預，觀察其對LIRI的保護作用。

1 材料

1.1 儀器

DH-150型動物呼吸機（浙江大學醫學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

利多卡因注射液（江蘇濟川制藥有限公司，批號：080531，規格：40 mg ∶5 ml）；苯巴比妥鈉注射液（廣東邦民制藥有限公司，批號：041042，規格：100 mg ∶1 ml）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1、IL-6和IL-8檢測試劑盒（美國eBioscience公司）。

1.3 動物

2 方法

2.1 建模

大鼠經耳緣靜脈注射30 mg/kg的苯巴比妥鈉麻醉，氣管切開后插管，接動物呼吸機控制呼吸，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側肺通氣8～10 ml/kg，雙側肺通氣15～20 ml/kg，呼吸比1 ∶2。然后經胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷周圍組織，游離左肺門，呼氣末時結扎右肺門，60 min后開放行再灌注，制成LIRI模型。

2.2 分組與給藥

取90只大鼠隨機均分為假手術組、模型組和預處理組，每組30只。模型組大鼠行左肺缺血再灌注，即開胸游離左肺門后，阻斷左肺門60 min，而后松開血管夾形成再灌注；假手術組大鼠只開胸而不行左肺缺血再灌注；預處理組大鼠術前15 min注射利多卡因1.2 mg/kg，并以1 mg/（kg·h）維持30 min，阻斷左肺門60 min，而后松開血管夾形成再灌注。

2.3 標本采集與指標檢測

各組大鼠于缺血30 min和再灌注60、120 min時采集標本。采集大鼠支氣管肺泡灌洗液，采用考馬斯亮藍染色法對其蛋白總量（TP）進行測定；收集支氣管肺泡灌洗液沉渣，計數白細胞（WBC）數量，并采用瑞氏染色進行白細胞分類，計算中性粒細胞（PMN）比例；取一定的肺組織，應用天平稱量其濕質量（W），置于70 ℃烤箱烘烤48 h后，測量其干質量（D），計算肺組織的濕/干質量（W/D）比值；取肺組織配制成10%的組織勻漿，采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 TP、WBC數量、PMN比例、W/D比值結果

與假手術組比較，模型組大鼠再灌注60、120 min時和預處理組再灌注120 min時TP、WBC數量、PMN比例、W/D比值均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，預處理組大鼠再灌注60、120 min時TP、WBC數量、PMN比例、W/D比值均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數量、PMN比例和W/D比值比較見表1。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數量、PMN比例和W/D比值比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數量、PMN比例和W/D比值比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

與假手術組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量結果

與假手術組比較，模型組大鼠再灌注60、120 min時和預處理組再灌注120 min時肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，預處理組大鼠再灌注60、120 min時肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

與假手術組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

近年來，由于LIRI的存在使應用心肺置換術、心肺轉流術等的心肺疾病晚期患者臨床癥狀加重，成為術后恢復健康的重要障礙。有報道稱，肺移植術后因LIRI導致的死亡率高達16%～25%，嚴重影響了患者的生命健康，是臨床亟需解決的問題[3]。有關LIRI的發病機制至今不明，但多數研究認為其與以下因素有關：氧自由基的釋放、脂質過氧化反應、鈣穩態的失衡、炎性物質的浸潤、免疫因素的干擾及細胞凋亡[4]。其中，免疫因素的干擾占有舉足輕重的地位。

免疫因素可通過以下途徑參與到LIRI的發病機制中：（1）炎性細胞因子與相應受體結合，激活溶酶體使其溶解消化肺組織；（2）刺激血管內皮細胞分泌黏附分子，增加WBC的黏附作用及聚集作用；（3）刺激巨噬細胞分泌趨化性因子，加重炎癥反應，可使PMN大量聚集，導致細胞壞死，釋放過氧化物和溶酶體酶等，加劇免疫反應，從而導致肺組織損傷[5-7]。已有研究表明，在LIRI后的肺泡灌洗液中，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量顯著高于血漿中水平，提示了免疫反應在LIRI方面的重要性[8]。從本研究可以看出，模型組大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC數量、PMN比例及TP明顯高于假手術組（P＜0.05），說明在再灌注中確實存在肺組織損傷及WBC與PMN的聚集。隨著再灌注時間的推移，損傷及聚集作用隨疾病進展逐漸加劇。模型組大鼠中再灌注60、120 min時肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量明顯高于假手術組（P＜0.05），驗證了炎性細胞因子參與了LIRI的發病機制，并且肺組織勻漿炎性因子含量隨疾病的進程相應增加，說明炎性因子隨疾病進展存在著相對應的變化。這一研究結果與國內相關研究[9-10]基本吻合，均提示免疫因素在LIRI疾病中起著重要作用。

隨著人們對LIRI發病機制研究的逐步深入，可應用多種內、外源性的化學物質對LIRI進行治療，從而達到保護肺的作用。其治療藥物根據不同的機制可分為以下幾類：（1）抗氧化劑或抗氧化酶，如膽紅素、黃酮類、氨溴索；（2）抑制細胞核因子κB（NF-κB）信號通路因子，如抗炎性因子、山莨菪堿、前列腺素E1等；（3）通過信號分子途徑，如吸入一氧化氮及一氧化碳、烏司他丁、黃酮化合物等；（4）炎癥因子和細胞黏附因子，如鹽酸氨溴索、糖皮質激素、分泌型白細胞蛋白酶抑制劑、羅格列酮等[11]。其中，利多卡因被認為是膜穩定劑，可抑制中性粒細胞的炎性反應，通過多種途徑來減輕LIRI并加大肺損傷的修復，其機制可歸納為以下幾點：（1）穩定細胞膜，抑制炎性反應的各個環節；（2）促進肺泡上皮細胞生長，抑制肺泡上皮細胞凋亡[12]。從本研究結果可以看出，應用利多卡因一段時間后，大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC數量、PMN比例及TP明顯低于模型組（P＜0.05），肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量也明顯低于模型組（P＜0.05），提示利多卡因可通過抑制炎癥反應來減緩LIRI，從而改善肺組織損傷，符合國內外對利多卡因作用機制的研究。

綜上所述，本實驗建立在針對大鼠的LIRI模型上，在不同時間點上動態觀察了免疫相關指標在疾病進程中的變化，并體外給予利多卡因，觀察了免疫相關指標的變化。LIRI的主要病理改變為肺組織內皮的廣泛破壞、肺毛細血管通透性的增加，從而導致肺泡和間質的水腫和損傷。其機制復雜，早期給予干預措施，可大大提高治愈率和預后恢復。本研究結果顯示，免疫因素尤其是炎性細胞因子在LIRI的疾病進展中發揮了重要作用，利多卡因可通過抑制炎性反應來改善肺組織的損傷。本實驗從炎性反應因子這一角度探討了利多卡因改善LIRI的機制，為臨床應用該藥提供了理論依據，但其臨床具體應用仍需進一步研究。

[1]基鵬，姜濤，李羽，等.大劑量辣椒素耗竭初級感覺傳入神經對兔肺缺血再灌注損傷氧化應激的影響[J].四川大學學報：醫學版，2014，45（2）：245.

[2]周燕，游古蓮，裘松波，等.阿替卡因與利多卡因在下頜牙慢性牙髓炎急性發作開髓術中的麻醉效果比較[J].中國藥房，2013，24（48）：4 543.

[3]王昕，陳莉芬，譚昌洪，等.枸杞多糖對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用[J].中國藥房，2014，25（15）：1 365.

[4]賈玉晶，朱曉鶴，馮力，等.新型氮氧自由基對心腦缺血/再灌注損傷模型大鼠的保護作用研究[J].中國藥房，2014，25（17）：1 565.

[5]譚敬，朱宇麟，周榮勝，等.烏司他丁對肝大部切除合并缺血再灌注損傷后肝再生和能量代謝的影響[J].西安交通大學學報：醫學版，2014，35（1）：89.

[6]金健，樸尚國，金英順，等.普伐他汀對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制探討[J].中華腎臟病雜志，2014，30（2）：139.

[7]侯四川，高健剛，李奎，等.核轉錄因子NF-E2相關因子2在左卡尼汀減輕腎缺血再灌注損傷中的作用[J].中華腎臟病雜志，2014，30（1）：60.

[8]王艷蕾，吳麗，李筠璐，等.七葉皂苷鈉對腸缺血再灌注損傷大鼠p38MAPK信號通路的影響及其保護作用機制[J].吉林大學學報：醫學版，2014，40（1）：60.

[9]洪芬芳，張大雷，涂桂林，等.缺血預處理通過抑制白三烯C4生成減輕大鼠肝缺血再灌注損傷[J].中國病理生理雜志，2013，29（3）：537.

[10]張良，代維，高志明，等.血必凈注射液和丹參注射液治療兔肢體缺血再灌注損傷的比較研究[J].重慶醫學，2013，42（31）：3 724.

[11]伊雪，王帥，鄔鵬宇，等.萊菔硫烷預處理對大鼠移植心臟冷缺血再灌注損傷的影響[J].實用醫學雜志，2013，29（23）：3 850.

[12]朱小兵，劉志群，吳論，等.mito-KATP通道在利多卡因預先給藥減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學雜志，2013，33（11）：1 322.