FimH1-156融合基因的構建及其原核蛋白表達與純化＊

尹仕偉，鄒麗云，張 瑩，張晉宇，唐 莎，施維維，吳玉章，袁發煥，張靜波△

（1.第三軍醫大學新橋醫院腎內科，重慶40037；2.第三軍醫大學全軍免疫研究所，重慶40038）

自身免疫性疾病的發病機制主要是病原體通過分子模擬機制打破機體免疫耐受：即病原體某些抗原表位與宿主組織蛋白的結構相同或相似，導致病原體刺激機體產生的免疫應答直接作用于結構相似的自身組分［1］。Kain等［2］對寡免疫復合物局灶壞死性腎炎（FNGN）的研究發現了分子模擬的直接證據：尿路致病性大腸桿菌（pyelonephritic E.coli，UPEC）Ⅰ型菌毛FimH蛋白表位P72-80與人溶酶體膜蛋白2（lysosome membrane protein 2，LAMP-2）致病表位P41-49具有100%的同源性，機體通過識別細菌FimH抗原的同時，對自身的LAMP-2蛋白也發生了交叉反應。有研究發現，UPEC存在于多種菌毛，包括：P型、S型、Dr家族黏附素和Ⅰ型菌毛等［3］。Ⅰ型菌毛作為重要毒力因子在UPEC中分布廣泛，除黏附定殖能力外，FimH位于最頂端，是真正的黏附素能夠與含有甘露糖的糖蛋白受體結合，介導細菌與多種宿主細胞黏附［4］。FimH蛋白在免疫方面也起重要作用［2］。然而，感染UPEC的患者與發生自身免疫疾病、甚至FNGN的可能機制有待進一步探討。本研究通過克隆含有與LAMP-2P41-49完全同源序列的UPECⅠ型菌毛FimH1-156為目的基因的原核載體，表達并純化其融合蛋白，為建立FNGN實驗動物模型提供材料和基礎，也為基于LAMP-2靶抗原的多肽疫苗研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a（＋）質粒由全軍免疫研究所鄒麗云教師贈送，含FimH1-156基因序列的pPKL241質粒由丹麥Per Klemm教授饋贈，大腸桿菌DH5α由本室保存，感受態菌株BL21（DE3）購自北京中杉公司。BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、DNA Marker、T4DNA連接酶均購自大連Takara公司；預染蛋白 Marker（10×103～170×103）購自 MBI公司；質粒提取試劑盒和膠回收試分析試劑盒均購自Omega公司；IPTG購自Merk公司；Ni-NTA樹脂購自Qiagen公司；抗6×His抗體購自Abcam公司。引物合成，質粒測序由英濰捷基（上海）公司完成。

1.2 原核表達質粒pET28a（＋）-FimH1-156的構建 根據FimH1-156的編碼區序列設計特異性引物，上游引物序列為5′-ACG GGA TCC AAA CGT GTT ATT ACC CTG TTT GC-3′（含BamHⅠ酶切位點），下游引物的序列為：5′-CGG AAG CTT TTA GCC GCC AGT AGG CAC CAC CA-3′（含 HindⅢ酶切位點），引物均由英濰捷基（上海）公司合成。以質粒pPKL241為模板進行PCR擴增，反應條件：98℃2min；98℃10s、55℃20s、72℃45s，循環30次；72℃延伸2min。用BamHⅠ、HindⅢ分別酶切PCR產物與pET28a（＋）質粒，經瓊脂糖凝膠回收，將載體和目的片段用T4連接酶室溫連接5 h。將連接的重組質粒pET28a（＋）-FimH轉化E.coli DH5α，在含有10mg／L卡拉霉素的LB瓊脂糖培養基平板中37℃培養過夜。沿平板一直徑挑選3個菌落，擴增后提取質粒，并用KpnⅠ與HindⅢ酶切鑒定，并送英濰捷基（上海）公司測序，確認得到正確的重組質粒，重組質粒命名為pET28a-FimH1-156。

1.3 FimH1-156的誘導表達及純化 將測序正確的重組質粒pET28a-FimH1-156轉化E.coli BL21（DE3），在含有10mg／L卡拉霉素的LB培養基中37℃搖菌過夜，后以1∶100轉接到20 mL新鮮的含10mg／L卡拉霉素的LB培養基。37℃搖菌2 h，A600nm約為0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0.00、0.01、0.10、1.00mmol／L，37℃搖菌誘導4h，6 000r／min 4℃低溫離心10min收菌。對上清液和沉淀均進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，判定表達形式。誘導表達的融合蛋白包含有6×His片段，適用Ni-NTA樹脂親和層析法純化目的蛋白。用10倍體積PBS重懸細菌，分別用10、20、50、100、250、500mmol／L 咪 唑、0.5mol／L 氯 化 鈉、10mmol／L Tris-HCl（pH＝8.0）溶液洗脫。

1.4 SDS-PAGE及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測 將純化后的FimH1-156蛋白進行SDS-PAGE分析，300mA轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜2h，50g／L的脫脂奶粉室溫封閉1h，抗6×His（一抗：1∶1 000）室溫孵育1h，PBS-Tween20（PBST）洗膜3次，每次10min，羊抗鼠IgG（二抗：1∶5 000）室溫孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min。加入發光劑后曝光、顯影。

2 結 果

2.1 重組質粒pET28a（＋）-FimH酶切及鑒定 pPKL241-FimH1-156基因PCR產物、pET-28a（＋）經BamHⅠ和HindⅢ酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，pET-28a（＋）在5 000～6 000有一特異條帶，FimH1-156在549bp處有特異條帶（圖1）。pET-28a（＋）與FimH1-156基因PCR擴增產物連接后，轉化DH-5α，沿平板一條直徑，挑取3個單克隆，KpnⅠ為FimH1-156基因序列上的一個酶切位點，經KpnⅠ和HindⅢ酶切后，可見圖2“1、3”為FimH基因連接上載體，而“2”為載體自連接。進一步對重組質粒送至英濰捷基（上海）公司進行DNA測序，結果序列和閱讀框均完全正確。

圖1 FimH1-156基因PCR產物及pET-28a（＋）載體電泳分析

2.2 目的蛋白的純化 篩選到的陽性pET28a（＋）-FimH1-156，將表達菌E.coli BL21（DE3）于37℃振蕩培養至A600nm值為0.6時，在誘導溫度為37℃、誘導時間為4h、IPTG濃度依次0.00、0.01、0.10、1.00mmol／L，在IPTG濃度為1.00mmol／L時，目的蛋白的表達最高。表達形式主要以包涵體表達（圖3）。進一步嘗試pET28a（＋）-FimH1-156在E.coli BL21（DE3）于16℃低溫誘導表達，電泳檢測顯示無目的蛋白誘導表達。Ni-NTA親和層析純化，可見250mmol／L咪唑洗脫液中有少量目的蛋白，但濃度較低（虛線↑），流穿溶液中仍然有較多蛋白（實線↑），表明純化效果不太好，蛋白掛柱能力差，見圖4。

圖2 重組原核表達載體pET28a（＋）-FimH1-156的酶切分析

圖3 不同濃度IPTG誘導及融合蛋白表達的SDS-PAGE分析

圖4 重組質粒pET28a（＋）-FimH1-156表達純化檢測

2.3 目的蛋白的鑒定 取未誘導E.coli BL21（DE3）／pET28a（＋）-FimH1-156對照菌株；純化后重組蛋白FimH1-156和超聲后上清液及沉淀，進行Western blot鑒定，抗體為抗6×His單克隆抗體（圖5），表明FimH融合基因pET28a（＋）-FimH1-156在E.coli BL21（DE3）中正確表達，形式為包涵體表達。

圖5 FimH1-156融合蛋白的Western blot分析

3 討 論

抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎（ANCA-associated systemic vasculitis，AASV）是一種典型的自身免疫性疾病，已證實傳統的ANCA相關的靶抗原有中性粒細胞髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）及蛋白酶3（protease 3，PR3）。van Putten等［5］研究韋格納肉芽腫與金黃色葡萄球菌感染的關系中，明確了感染與自身抗體的間接證據，但一直未能找到感染與MPO或PR3相關的直接證據。抗LAMP-2抗體是最近才發現的ANCA新亞型，Kain等［6］關于FNGN發病機制的研究提示，UPEC入侵人體后，宿主通過FimH啟動針對LAMP-2的自身免疫是LAMP-2-ANCA相關性FNGN發病機制的關鍵，這提供了分子模擬的直接證據。目前，抗LAMP-2抗體被認為是AASV更為特異而有效的標志，存在于幾乎所有的FNGN患者中，與病變的相關性是傳統抗MPO及PR3-ANCA的2倍［6］；然而，有關抗LAMP-2抗體的臨床實際價值仍存在較大的爭議，有報道就對抗LAMP-2抗體與疾病的相關性提出質疑，更多標準化的實驗有待進一步研究［7-8］。

Kain等［2］的研究證實了人FNGN的LAMP-2靶抗原的致病性的表位，即P41-49（HGTVTYNGS）和P331-341（QGKYSTAQDCS），并成功構建了WKY大鼠FNGN動物模型。明確致病性表位后，特異性誘導針對LAMP-2靶抗原的免疫耐受，這有望成為個性化治療FNGN的有力手段，也為基于LAMP-2靶抗原的多肽疫苗開發提供了可能。作者利用LAMP-2靶抗原的致病性的表位P41-49多肽聯合完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA），乳化 后皮下注射 WKY 大鼠建立FNGN模型實驗已經完成，3只實驗組大鼠24h尿蛋白定量明顯增多，但腎病理檢查未見明顯新月體及小球壞死，這可能與人工合成多肽免疫原性低有關。本研究成功構建了表達質粒pET28a（＋）-FimH1-156，采用大腸桿菌表達，獲得免疫原性更高的UPECⅠ型菌毛FimH1-156表達蛋白，通過Ni-NTA純化后，利用標簽抗體進一步間接鑒定了該表達蛋白，與文獻報道結果類似［9］，該蛋白的表達形式也為包涵體，這可能與表達蛋白自身特性有關。隨后，作者采用反復凍融、超聲、離心和反復洗滌的方法，經SDS-PAGE分析，切膠純化出較高純度的FimH1-156融合蛋白，為進一步采用FimH1-156融合蛋白誘導WKY大鼠建立FNGN模型奠定基礎。

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