富氫生理鹽水對大鼠重度顱腦損傷后氧化應激保護作用的研究

徐其嶺，閆 莉

（1．鄭州人民醫院神經外科，鄭州450000；2．河南省人民醫院CT室，鄭州450000）

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是對腦組織的一種物理性損傷，可引起暫時性或永久性腦功能損傷，繼發性的腦損傷被認為是患者病情加重的重要因素［1］。盡管一系列的醫療干預措施如采用高壓氧治療、亞低溫以及早期康復治療在很大程度上能降低顱腦損傷的病死率，改善預后，提高生存質量。但目前仍然沒有行之有效的治療TBI的神經保護藥物［2］。研究表明TBI后，壞死神經組織產生的炎性反應，如氧化應激產生的大量活性氧自由基對腦組織具有損害作用，并在繼發性腦組織損傷和功能恢復中發揮重要作用。富氫生理鹽水（HS）是一種優質的選擇性抗氧化劑，其在臨床醫學實驗中的研究主要集中于對缺血再灌注引起的肺臟、腸及腦損傷的保護作用。目前關于HS對重度顱腦損傷（severe trau matic brain injury，STBI）引起的機體氧化應激損傷的影響作用尚不明了，本研究通過建立STBI大鼠模型，給予HS治療，檢測大鼠血漿中丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性，探討HS對TBI大鼠機體氧化應激水平的影響作用。

1 材料與方法

1．1 動物選擇 健康的雄性Wistar大鼠60只，體質量250～300 g，由河南省動物實驗中心提供。所有實驗動物給予國家標準嚙齒類動物飼料喂養，自由飲食飲水，動物均在相同條件下進行飼養。

1．2 大鼠STBI模型的建立 根據參考文獻資料，采用控制性皮質撞擊損傷進行大鼠STBI模型的建立［3-4］。將大鼠用40 mg／kg戊巴比妥鈉麻醉后固定于立體定向儀上。用硫化物脫毛劑除去大鼠頭頂部被毛，頂部皮膚用碘伏消毒后切開，分離暴露顱骨。采用高速鉆機行6 mm顱骨切除術。致傷點選擇介于人字縫和前囪縫合線的右側感覺運動皮質，用帶有尖端直徑5 mm的氣動活塞撞擊器裝置以4．0 m／s的速度撞擊腦部達到3．0 mm深度，并置于腦部120 min建立STBI模型。手術后，用骨蠟進行密封并縫合皮膚。假手術組僅進行顱骨開窗，不做打擊致傷。

1．3 HS的制備 HS的制備參考文獻［5-6］進行。將袋裝250 mL醫用生理鹽水抽出50 mL，加入50 mL純凈的氫氣（購自上海基量標準氣體有限公司，純度為100%）并充分混合。將含氫的生理鹽水置于0．4 MPa壓力下穩壓12～24 h，達到飽和狀態，制備HS，使氫氣濃度保持在0．6 mmol／L左右，經r輻射消毒滅菌后裝于鋁袋中常壓4℃保存。HS的濃度采用氣相色譜法進行檢測［7］。HS需要每周新鮮配制保證氫的濃度不低于0．6 mmol／L。

1．4 動物分組及實驗方案 將60只大鼠隨機分為假手術組、STBI＋生理鹽水（NS）組和STBI＋HS組，每組20只。STBI＋NS組在STBI手術后5 min內經腹腔注射NS 10 mL／kg，STBI＋HS組在STBI術后5 min內經腹腔注射HS 10 mL／kg。3組動物分別于STBI術前和術后12、24、48 h檢測血漿中MAD水平以及SOD和GSH-PX的活性。

1．5 指標檢測

1．5．1 血漿樣本中MDA水平的檢測 依據硫代巴比妥酸比色法進行。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明操作。其中樣品中MDA含量＝（測定管吸光度-測定空白管吸光度）／（標準管吸光度-標準空白管吸光度）×10 mmol／L×樣本稀釋倍數。

1．5．2 血漿樣本中SOD活性的檢測 依據黃嘌呤氧化酶法進行。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明操作。樣品中SOD活性＝（對照管吸光度-測定管吸光度）×稀釋倍數／對照管吸光度×1／2。

1．5．3 血漿樣本中GSH-PX活性的檢測 依據5，5′-二硫代-雙-硝基苯甲酸顯色法。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明操作。GSH-PX活性＝（對照管吸光度-測定管吸光度）×標準管濃度×樣本稀釋倍數。

1．6 統計學處理 采用SPSS16．0統計軟件進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0．05說明差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 血漿中MAD水平 與同組術前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的MDA水平在術后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。與假手術組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動物血漿中MDA水平在術后24 h和48 h均明顯升高（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS組的MDA水平在術后24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。見表1。

2．2 血漿中SOD活性 與同組術前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的SOD活性在術后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。與假手術組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動物血漿中SOD活性在術后24 h和48 h均明顯降低（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS組的SOD活性在術后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。見表2。

2．3 血漿中GSH-PX活性 與同組術前相比，STBI＋NS組及STBI＋HS組的GSH-PX活性在術后12 h有所增高（P＜0．05），但在24 h和48 h明顯降低（P＜0．05）。與假手術組比較，STBI＋NS組及STBI＋HS組動物血漿中GSH-PX活性在術后24 h和48 h均明顯降低（P＜0．05）。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS治療組的GSH-PX活性在術后24 h和48 h明顯升高（P＜0．05）。見表3。

表1 STBI術前及術后不同時間點血漿中MDA水平比較（±s，n mol／mL）

表1 STBI術前及術后不同時間點血漿中MDA水平比較（±s，n mol／mL）

a：P＜0．05，與同組術前比較；b：P＜0．05，與假手術組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術前 術后12 h 術后24 h 術后48 h假手術組20 3．21±0．13 3．56±0．09 3．68±0．08 3．79±0．14 STBI＋NS組 20 3．45±0．16 3．72±0．09 8．25±0．11 ab 18．69±0．05 ab STBI＋HS組 20 3．34±0．06 3．64±0．12 4．71±0．13abc 5．68±0．16 abc

表2 STBI術前及術后不同時間點血漿中SOD活性比較（±s，U／mL）

表2 STBI術前及術后不同時間點血漿中SOD活性比較（±s，U／mL）

a：P＜0．05，與同組術前比較；b：P＜0．05，與假手術組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術前 術后12 h 術后24 h 術后48 h假手術組 20 132．61±8．92 135．79±0．02 131．86±8．92 137．13±13．42 STBI＋NS組 20 138．27±6．13 145．63±11．21a 109．12±7．62 ab 92．37±10．61 ab STBI＋HS組 20 135．42±9．21 156．25±5．46 a 121．59±10．13 abc 110．28±9．89 abc

表3 STBI術前及術后不同時間點血漿中GSH-PX活性比較（±s，U／mL）

表3 STBI術前及術后不同時間點血漿中GSH-PX活性比較（±s，U／mL）

a：P＜0．05，與同組術前比較；b：P＜0．05，與假手術組比較；c：P＜0．05，與STBI＋NS組比較。

組別 n 術前 術后12 h 術后24 h 術后48 h假手術組20 0．52±0．01 0．54±0．05 0．53±0．06 0．51±0．03 STBI＋NS組 20 0．48±0．02 0．55±0．04a 0．42±0．03 a 0．39±0．01 a STBI＋HS組 20 0．53±0．03 0．58±0．01 a 0．48±0．02 ab 0．44±0．05 abc

3 討 論

氧化應激是由于各種內外因素的刺激引起機體組織內或細胞內的氧自由基生成的增多和（或）清除能力降低，從而導致氧自由基在體內或細胞內蓄積，體內過多的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，出現脂質過氧化，造成細胞或組織氧化損傷，從而引起細胞損傷或凋亡，加劇機體的炎性反應［8-9］。MDA是氧自由基攻擊細胞膜中多不飽和脂肪酸后生成的脂質過氧化產物，其作為強交聯劑，與蛋白質、核酸或脂類結成難溶性物質，使生物膜通透性降低，繼而引起細胞破裂和（或）死亡，MDA水平的變化間接反映體內脂質氧化及組織損傷程度且性質較穩定。機體的抗氧化能力取決于脂質過氧化程度和抗氧化保護的動態平衡，目前研究認為SOD、GSH-PX是機體中重要的抗氧化物酶。其中，SOD在機體的氧化與抗氧化平衡中起著關鍵作用，主要通過清除人體中超氧化物和H2O2，保護細胞生物膜結構和功能的穩定性。谷胱甘肽是一種低分子自由基清除劑，可直接或間接清除H2O2、·OH等，是外源性和內源性的抗氧化劑。當機體血漿中出現MDA含量升高，SOD、GSH-PX下降，一般認為機體出現損傷，引起脂質過氧化，產生了氧化性應激。

目前關于氫氣抗氧化作用的研究日益成為國內外學者關注的焦點［10］。氫是無色、無嗅、無味具有低還原性的雙原子氣體。而近年相關的研究認為，氫氣不是生理性惰性氣體，而是一種理想的抗氧化物質，具有選擇性抗氧化作用，可特異性中和細胞內有害自由基，保護DNA、蛋白質等不被破壞，維持線粒體正常功能，阻止細胞凋亡［11-13］。HS是將氫氣通過高壓溶解于生理鹽水中，關于氫氣對機體各種外源性因素引起的氧化應激的影響作用存在不一致的研究結果［14］。任漢強等［11］的研究結果表明，HS對高糖所致內皮細胞氧化損傷具有保護作用，可有效降低人臍靜脈內皮細胞內ROS的生成和抗氧化酶減少，發揮抗細胞凋亡的作用。也有研究發現，腹腔注射HS可以顯著提高大鼠腹部臟器如肝、腎等組織內的氫濃度，并對腦、腸缺血再灌注損傷動物模型都有較好的保護作用。Matchett等［15］研究結果發現，吸入2%氫氣后對中度及重度新生兒缺血缺氧腦病大鼠模型療效不明顯。但是Xie等［16］研究表明，2%氫氣吸入對嚴重膿毒血癥小鼠具有保護作用。Ji等［17］研究表明，吸入氫氣可通過降低腦組織中氧化產物的產生及提高抗氧化酶活性對TBI大鼠具有顯著保護作用。

大量的動物實驗表明，TBI后機體的氧自由基反應增強。腦組織在生理情況下清除自由基主要依靠兩類物質，酶和天然的抗氧化劑。自由基的生成和清除之間保持動態平衡，以維持機體功能的正常和結構完整，但在某種病理情況下，自由基的生成超出機體清除能力時會造成機體的組織損傷。由于腦組織脂質豐富，抗氧化能力較弱，因此極易受到自由基的攻擊而發生氧化應激損傷。控制性皮質撞擊損傷模型作為復制局部TBI的成熟模型廣泛用于小鼠和大鼠前后腦組織中細胞和分子改變的研究中。因此，本研究采用控制性皮質撞擊損傷誘導的TBI模型，結果表明，STBI手術過程中存在一定程度的氧化應激損傷。與術前相比，STBI手術組動物血中MDA水平在顱腦損傷24 h和48 h后顯著升高；與術前相比，STBI手術組動物血中的SOD及GSH-PX的活性在顱腦損傷后12 h有所升高，但在STBI 24 h和48 h后顯著降低，提示STBI手術過程中機體受到刺激，生成大量氧自由基，引起了機體脂質過氧化，發生了氧化性應激。與STBI＋NS組相比，STBI＋HS治療可以顯著降低STBI傷后MDA的水平，增加STBI術后SOD及GSH-PX的活性。

綜上所述，在大鼠STBI模型中，HS治療可有效降低神經損傷引起的機體氧化產物的生成和抗氧化酶的減少，對氧化應激損傷具有保護作用。采用新的抗氧化劑HS治療可能成為治療TBI更有效的治療策略。

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