利用SSH技術(shù)鑒定黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因

劉大軍 秦智偉 周秀艷 辛 明 武 濤

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150070）

利用SSH技術(shù)鑒定黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因

劉大軍1，2秦智偉1*周秀艷1辛 明1武 濤1

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150070）

采用SSH技術(shù)對黃瓜抗霜霉病自交系M801-3-1侵染霜霉病菌前后的差異表達基因進行了研究。利用 SSH 技術(shù)構(gòu)建抗病黃瓜材料接種霜霉病菌和未接種差異表達的差減cDNA文庫。經(jīng)反向Northern blot雜交檢測，共得到48個陽性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對測序后的序列進行質(zhì)量檢測和聚類、拼接，共得到 14個UniESTs，其中包括8個singletons和6個contigs。通過SSH-EST代表基因功能的分析，說明抗氧化脅迫能力和葉綠體的重建和保護機制對抗病品種抗病有重要作用。同時，提出SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順反異構(gòu)酶還可能參與了R基因介導(dǎo)的防御反應(yīng)，smHSP有可能就是R蛋白的“保衛(wèi)靶”，負責(zé)監(jiān)測細胞內(nèi)的異常，這一發(fā)現(xiàn)為揭示活性氧機制和R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)機制之間的關(guān)系提供了關(guān)鍵證據(jù)。

黃瓜；霜霉病；SSH技術(shù)

黃瓜霜霉病是由卵菌綱的古巴假霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）引起的。黃瓜生產(chǎn)中霜霉病是具有毀滅性的葉部病害，近年來隨著病原菌的變異，有加速流行的趨勢。Helena等（2011）結(jié)合前人的研究對黃瓜霜霉病抗性遺傳的相關(guān)問題進行了系統(tǒng)的論述（劉艷玲 等，2009；李建武，2010）。人們已經(jīng)對黃瓜霜霉病的發(fā)病過程十分了解（石延霞，2002；劉艷玲 等，2009），利用藥劑防治已經(jīng)可以在一定程度上控制該病的發(fā)生（朱書生，2005；張曉，2008；喬桂雙，2009），但藥劑的使用存在食品安全問題和環(huán)境問題，同時也存在霜霉病菌的抗藥性問題（劉曉宇，2004）。培育并使用抗病品種無疑是減輕該病危害的最有效措施（Branca et al.，2005；李建武，2010；牛德 ，2010）。因此，黃瓜抗霜霉病基因的發(fā)掘和黃瓜抗霜霉病機制的深入研究對于黃瓜抗霜霉病育種和黃瓜生產(chǎn)實踐具有重要意義。

抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)是由Diatchenko等（1996）提出。Yang等（1999）將SSH技術(shù)與微陣列篩選技術(shù)進行了有機結(jié)合，大大提高了鑒定差別表達基因檢測的效率。SSH技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功應(yīng)用于抗病基因分離的研究。駱蒙（2001）構(gòu)建了白粉病誘導(dǎo)小麥葉片的特異性差減文庫，獲得大量EST序列，根據(jù)這些EST推測肌醇脂信號系統(tǒng)、SA信號系統(tǒng)、MAP相關(guān)信號傳遞系統(tǒng)可能參與小麥白粉病過程。于秀梅（2006）構(gòu)建了小麥接種條銹菌后不同時間的cDNA文庫，共獲得652個抗病相關(guān)基因和抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Unigenes。劉蕾等（2012）構(gòu)建了青枯菌侵染相關(guān)的抑制性差減雜交文庫，篩選出44個差異表達基因，并利用基因敲出技術(shù)對差異表達進行功能驗證。趙胡 （2012）構(gòu)建了鎘脅迫的SSH文庫，分離出600個獨立克隆。Norelli等（2009）構(gòu)建了蘋果火疫病侵染前后的SSH文庫，獲得468個非冗余序列，并得出侵染前后表達基因不同的結(jié)果。Verica等（2004）利用SSH技術(shù)構(gòu)建了可可葉片受病害相關(guān)激素類物質(zhì) BTH、JAS、ET和誘導(dǎo)子蛋白Nep1處理的差異表達EST文庫，鑒定出330個防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因。Peng等（2009）利用SSH構(gòu)建了綠僵菌產(chǎn)孢細胞發(fā)育過程中優(yōu)先表達的特異基因文庫，共獲得109個EST，推測這些基因參與綠僵菌產(chǎn)孢的發(fā)育調(diào)節(jié)。Zhao等（2008）利用SSH技術(shù)構(gòu)建了水稻紋枯病侵染水稻cDNA文庫，獲得50個差異表達克隆，發(fā)現(xiàn)這些基因中有25個與水稻稻瘟病和水稻白葉枯病侵染表達基因相同，并認為真菌和細菌的防御響應(yīng)基因是相同的。

前人已經(jīng)對黃瓜霜霉病的發(fā)病規(guī)律、黃瓜抗霜霉病機制做了大量研究。丁國華等（2005）采用抗病基因類似序列（resistance gene analog，RGA）克隆和標記基因的策略，獲得了15個RGA片段。李金鑫（2007）以抗霜霉病黃瓜東農(nóng)129為試材，利用差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（DDRT-PCR）研究了黃瓜接種霜霉病菌前后基因表達的差異，鑒定出了4個抗病相關(guān)基因。王麗娟等（2010）以抗霜霉病黃瓜品種649的葉片為材料，接種黃瓜霜霉病菌后，構(gòu)建了黃瓜葉片全長cDNA文庫，得到427個與植物防御、抗病相關(guān)的基因。李建吾等（2011）以高抗霜霉病的黃瓜自交系為材料，構(gòu)建了兩個抑制差減文庫，經(jīng)反向Northern雜交篩選、測序和序列比對，篩選到3個未知功能抗病相關(guān)基因。Taler等（2004）通過部分測序甜瓜的抗霜霉病的差異蛋白得到2個基因At1和At2，轉(zhuǎn)基因試驗證明基因At1和At2可提高感病甜瓜品種的抗霜霉病能力。康靜（2007）分別從甜瓜和黃瓜上克隆出了At2基因，并將其轉(zhuǎn)入黃瓜得到轉(zhuǎn)基因植株。黃瓜基因組測序完成后，大量黃瓜R基因被鑒定出來，At基因也被鑒定出來，并被列為黃瓜抗霜霉病的重要候選基因（Huang et al.，2009）。Taler等（2004）指出與經(jīng)典的R基因不同的是，基因At1和At2屬酶促抗性（enzymatic resistance）基因，簡稱eR基因，同時說明在甜瓜中可能也存在R基因介導(dǎo)的霜霉病抗性，只是目前尚未發(fā)現(xiàn)。本試驗在基因組測序已經(jīng)完成的背景下，利用抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)獲得多個與霜霉病菌侵染相關(guān)的EST序列，通過BLAST比對確定黃瓜基因組中與EST序列同源的基因，以期明確黃瓜抗霜霉病的相關(guān)基因的表達機制和黃瓜抗霜霉病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

試驗于2010年秋在哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地進行。以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組選育的抗霜霉病自交系M801-3-1和感病自交系M302-3為材料。在黃瓜霜霉病田間發(fā)病時從黃瓜病葉上收集病原菌，并在感病自交系M302-3上進行純化，接種后的葉片發(fā)病時收集病原菌。培育健康的M801-3-1幼苗，二葉一心時接種黃瓜霜霉病菌孢子懸浮液，孢子囊濃度為1×105個·mL-1，以噴施清水為對照，噴施于真葉的背面，放入光照培養(yǎng)室，溫度22 ℃，空氣濕度100%，塑料袋覆蓋幼苗，避免光照培養(yǎng)室內(nèi)空氣流動造成葉片萎蔫，先24 h黑暗處理，之后，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗）。在接種后的0、6、12、24、48、72 h取植株葉片，液氮處理后在-80 ℃中保存。

1.2 mRNA的分離和提取

使用TaKaRa 公司的 RNAiso Plus and RNAiso Mate for Plant Tissue 試劑盒進行總 RNA 的提取。mRNA 的分離、純化使用 A.P mRNA Purification Kit，純化后檢測 mRNA 樣品的濃度及純度。

1.3 SSH cDNA 文庫的構(gòu)建

SSH的全過程參考Clontech公司的PCRSelectTMcDNA Subtraction Kit使用手冊進行。以0～72 h侵染處理的混合試材作為 tester，將清水對照作為 driver。首先將分離、純化后的 mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈 cDNA，用 RsaⅠ對雙鏈 cDNA 進行酶切，在tester 兩端加上接頭1和接頭2R，進行2 次消減和2次 PCR擴增，富集差異表達基因。第1次PCR 反應(yīng)體系：無菌水19.5 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，PCR 引物 1（10 μmol·L-1） 2.0 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，總體積25.0 μL。第1次循環(huán)體系：27 個循環(huán)， 94 ℃30 s、66 ℃30 s、72 ℃1.5 min。第2次PCR 反應(yīng)體系：無菌水18.5 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μL，巢式引物1、巢式引物2R（10 μmol·L-1） 各 1.0 μL，dNTP（10 μmol·L-1） 0.5 μL，50×Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 μL，總體積24.0 μL。第2次循環(huán)體系：10～12 個循環(huán)，94 ℃ 30 s、68 ℃30 s、72 ℃1.5 min。引物和序列如下。接頭1 序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGGG CTCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'，5'-ACC TGCCCGG-3'；接頭2R序列：5'-CTAATACGACTCACTATAGG GCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5'-ACCTCGGCCG-3'。引 物1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC -3'。巢式引物1：5'-TCGAGCGGCCGCCGCCCGGGCAGGT-3'。巢式引物2R：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'（接頭1和接頭2R的序列、巢式引物序列根據(jù)手冊提供序列）。

1.4 差減文庫生成

兩次擴增產(chǎn)物用TaKaRa公司DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0進行純化，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞GM109，在Amp/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基上鑒定陽性克隆。挑取單個白斑菌落進行振蕩培養(yǎng)，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0提取質(zhì)粒。

1.5 反向Northern blot鑒定陽性克隆

制備探針：將0～72 h侵染處理的混合試材和清水對照試材分離、純化后的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，用RsaⅠ對雙鏈cDNA進行酶切，分別用地高辛（Roche）進行標記，檢測標記效率。

反向Northern驗證陽性克隆：利用巢式引物1（5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'）和 巢式引物2R（5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'）對提取的質(zhì)粒進行擴增。取擴增產(chǎn)物1 μL點在immobilon-Ny+帶正電尼龍轉(zhuǎn)印膜上，用標記好的探針與點陣膜進行雜交，具體操作方法參照Roche DIG-High Prime DNA Lableing and Detection Starter KitⅡ試劑盒的操作說明。

1.6 差異表達基因的測序及序列分析

1.6.1 序列前處理和聚類拼接 將經(jīng)過反向Northern blot驗證后有差異的陽性克隆送去測序。將測序后的數(shù)據(jù)進行前處理。首先利用vecscreen軟件或http：//ncbi.nlm.nih. gov/repository/vector 去除載體序列，再利用 RepBase（http：//www.girinst.org）去除重復(fù)和低質(zhì)量序列。將前處理后的序列利用CAP3軟件進行EST Cluster分析。

1.6.2 序列分析 將所有序列在NCBI上進行BLASTn和BLASTx同源性比對，并且利用geneontology（http：//www.geneontology.org）進行功能分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 的提取及 mRNA 的分離純化

經(jīng)純度、濃度檢測，提取的總RNA的質(zhì)量符合試驗標準，OD260/OD280在 1.8～2.0。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA 的帶形清晰，亮度比值約為2∶1，表明提取的 RNA沒有被降解。 純化的mRNA 呈抹狀彌散，說明 mRNA的質(zhì)量較好，可以用于構(gòu)建差減文庫。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的質(zhì)量

2.2 差異表達 cDNA 文庫的建立

將第2次PCR產(chǎn)物回收、純化，連接到pMD19-T載體上，在含有Amp/IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。隨機挑取文庫中的 1 000個陽性克隆，利用巢式引物 1 和巢式引物 2R 進行驗證，如圖 2 所示，片段分布主要集中在 100～500 bp，符合預(yù)期RsaⅠ酶切產(chǎn)物大小，說明陽性克隆中含有第2次PCR回收產(chǎn)物。隨機選取80個陽性克隆進行反向Northern blot鑒定。

圖2 cDNA文庫PCR驗證

2.3 反向Northern blot鑒定陽性克隆

將差減文庫中的PCR產(chǎn)物點在尼龍膜上，進行點陣列雜交篩選。試驗設(shè)計為差異表達cDNA文庫和兩個探針。選取出現(xiàn)在tester探針雜交膜上但未出現(xiàn)在 driver探針雜交膜上的陽性克隆，或在tester雜交膜和driver雜交膜上均出現(xiàn)，但信號強度有差別的陽性克隆。圖3為差減cDNA文庫的反向Northern blot驗證。最后確定48個陽性克隆進行測序。

圖3 反向Northern blot驗證

2.4 cDNA差異表達文庫序列分析

對利用反向Northern blot驗證得到的48個陽性克隆進行測序，獲得Est序列，通過CAP3軟件進行聚類拼接獲得6個重疊群Est（Contig1～6），8個獨立Est（53、70、73、33、17、52、61、77）。測序拼接結(jié)果在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI上進行BLAST 氨基酸序列同源性比對，結(jié)果顯示有11個Est找到了與之匹配的序列，其中包括4個功能未知的序列（表1）。另外，還有未找到任何比對信息的3個序列（Contig3、17、52），推測這3個序列可能為新Est序列。

表1 SSH-EST序列黃瓜基因組比對信息

3 討論

前人已經(jīng)對黃瓜的抗霜霉病基因進行了大量研究，認為黃瓜的抗霜霉病基因是由多對隱性基因控制的（Shimizu et al.，1963；Doruchowski & Lakowska-Ryk，1992；張勝菊和司龍亭，2009）。黃瓜抗霜霉病的機制相對于其他病害更加復(fù)雜，這可能是至今為止沒有明確地發(fā)現(xiàn)黃瓜抗霜霉病基因的主要原因。牛德（2010）構(gòu)建了接種霜霉病菌后4、8、16、24、48 h和72 h的抗霜霉病黃瓜品種649的葉片全長cDNA文庫，結(jié)果顯示：共有1 851個unigengs獲得相關(guān)的注釋信息，涉及44個非重復(fù)代謝途徑。接種霜霉病菌后的葉片cDNA文庫包含抗霜霉病相關(guān)基因，但更多的是與霜霉病抗性非相關(guān)的基因，這一結(jié)果使得后續(xù)進行抗病基因發(fā)掘和抗病機制分析的難度較大。李建武（2010）以高抗自交系IL57經(jīng)霜霉病菌接種32、48、56 h后和清水接種對照的葉片為材料，采用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的正、反向差減文庫，從正、反向差減文庫中分別得到了60個和26個非重復(fù)序列片段（singleton ESTs）。差減出的相關(guān)功能基因幾乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反應(yīng)過程并且與抗病反應(yīng)高度相關(guān)。

本試驗是以本課題組培育的高代抗病自交系M801-3-1為材料，在接種后的0、6、12、24、48、72 h取樣，獲得有效Est序列48個，通過CAP3軟件進行聚類拼接獲得6個重疊群Est（Contig1～6），8個獨立Est。相對于牛德（2010）的試驗結(jié)果，本試驗采用SSH技術(shù)更有利于霜霉病侵染相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，結(jié)果分析更簡便，針對性更強。相對于李建武（2010）的試驗結(jié)果，本試驗增加了早期取樣，早期取樣更能反映在黃瓜與霜霉病菌接觸的第一時間黃瓜做出的抗病性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，有利于揭示黃瓜抗病反應(yīng)的整個機制，尤其是前期的信號傳導(dǎo)機制和早期的應(yīng)激反應(yīng)機制。同時，由于試驗材料、取樣時間和操作方法的不同，本試驗獲得的Est與前人的研究結(jié)果有很大不同，后續(xù)將進行轉(zhuǎn)錄組測序試驗驗證本試驗結(jié)果的可靠性。李建武（2010）的研究認為活性氧誘發(fā)的過敏性抗病機制在黃瓜抗霜霉病中起重要作用，本試驗結(jié)果則表明降低過敏性的抗活性氧機制有助于提高抗性。

生物信息學(xué)分析顯示本試驗中SSH-EST片段的表達和活性氧引起的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，高溫、低溫、強光、生物侵染等逆境都能誘發(fā)上述基因的表達。逆境引起的活性氧傷害主要傷害生物膜和蛋白質(zhì)。清除或減少活性氧有助于減輕逆境造成的傷害。同時本試驗的結(jié)果也為石延霞（2002）關(guān)于高溫提高黃瓜抗霜霉病能力的試驗結(jié)果提供了分子水平的解釋，即熱激蛋白等熱激反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生不但提高了黃瓜的抗熱性，也提高了黃瓜抗霜霉病的能力。顧振芳等（2004）研究證實，黃瓜葉片中葉綠素的含量與黃瓜品系對霜霉病的抗性呈正相關(guān)。本試驗觀察到的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、HSP22、16S核糖體、clpb這些生物大分子的超量表達都和葉綠體的重建或保護機制有關(guān)。黃瓜抗霜霉病品種一般葉色較深，根本原因是因為細胞內(nèi)葉綠體較多，本試驗結(jié)果表明，維持葉綠體穩(wěn)定的機制和促進葉綠體形成的機制都有利于提高黃瓜抗霜霉病的能力。葉綠體的組成元件細胞色素和鐵氧還原蛋白等對活性氧極為敏感，逆境中保護葉綠體內(nèi)成分的穩(wěn)定是黃瓜能否生存的關(guān)鍵，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶具有清除活性氧的功能，鐵硫簇蛋白能夠促進鐵氧還原蛋白的形成，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另外，HSP22、HSP20、HSP70、clpb和肽脯氨酰異構(gòu)酶含量的變化可能構(gòu)成黃瓜過敏性反應(yīng)的信號，這些成分的大量表達可能標志著黃瓜的內(nèi)平衡受到破壞，信號進一步傳遞給R基因形成系統(tǒng)性過敏壞死反應(yīng)，即HR反應(yīng)。

總之，黃瓜維持葉綠體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和啟動葉綠體重建機制是抗霜霉病品種抗病機制的重要組成部分。只有維持黃瓜自身代謝的良性運轉(zhuǎn)才能為抗病反應(yīng)提供足夠的能源和材料。葉綠體可能是黃瓜與霜霉病病原菌生存競爭的“焦點”。

4 結(jié)論

本試驗利用 SSH 技術(shù)構(gòu)建抗病黃瓜材料接種霜霉病病原菌和未接種差異表達的差減cDNA文庫。經(jīng)反向 Northern blot雜交檢測，共得到48個陽性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對測序后的序列進行質(zhì)量檢測和聚類、拼接，共得到 14個 UniESTs，其中包括 8個 singletons 和 6個contigs。將上述 EST序列在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.icugi.org/）上進行 BLAST比對，有11個 EST 片段找到了與之匹配的同源序列，有3個 EST 片段未找到同源序列，推測可能是新基因。通過SSH-EST代表基因功能的分析，推論出抗氧化脅迫能力、葉綠體的重建和保護機制對抗病品種抗病有重要作用。同時SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順反異構(gòu)酶還可能參與了R基因介導(dǎo)的防御反應(yīng)，smHSP有可能就是R蛋白的“保衛(wèi)靶”，負責(zé)監(jiān)測細胞內(nèi)的異常。

本試驗獲得的UniESTs雖然有限但更有針對性，大多和活性氧反應(yīng)相關(guān)，活性氧迅速產(chǎn)生可使黃瓜在受侵染部位產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，非侵染部位抑制活性氧產(chǎn)生可使壞死斑受限制形成抗病反應(yīng)。活性氧應(yīng)激反應(yīng)一方面反映了黃瓜受霜霉病菌侵染后對于自身內(nèi)環(huán)境的平衡性修復(fù)需要，另一方面也可能作為逆境信號的傳導(dǎo)機制，啟動黃瓜抗病的形態(tài)建成和生理環(huán)境。活性氧應(yīng)激反應(yīng)在其他溫度逆境、水分逆境、光照逆境和生物侵染逆境中可能具有相似作用。利用活性氧應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)理論可以育成更加抗病的黃瓜品種，也可以制定出相應(yīng)的栽培技術(shù)措施進行黃瓜病害的綜合防治。

今后可利用RNAi干擾技術(shù)敲出和超量表達SSH-EST相關(guān)基因，驗證這些基因在黃瓜抗霜霉病中的功能。也可以利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，進一步分析引起黃瓜不同品種產(chǎn)生抗感差異的機制。

參考文獻

丁國華，秦智偉，劉宏宇，周秀艷，池春玉，王志坤．2005．黃瓜NBS類型抗病基因同源序列的克隆與分析．園藝學(xué)報，32（4）：638-642．

顧振芳，王衛(wèi)青，朱愛萍，朱曉敏，何歡樂，潘俊松，蔡潤．2004．黃瓜對霜霉病的抗性與葉綠素含量、氣孔密度的相關(guān)性．上海交通大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，22（4）：381-384．

康靜．2007．氨基轉(zhuǎn)移酶基因eR基因的克隆及在黃瓜中的遺傳轉(zhuǎn)化〔碩士論文〕．長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)．

李建武．2010．黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因篩選及過敏性抗病機制〔博士論文〕．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)．

李建吾，司勝偉，胡建斌，劉麗君．2011．黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的初步研究．園藝學(xué)報，38（3）：471-478．

李金鑫．2007．抗霜霉病相關(guān)基因的鑒定〔博士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

劉蕾，徐進，許景升，張麗勍，張昊，馮潔．2012．應(yīng)用抑制性差減雜交法篩選植物青枯菌致病相關(guān)基因．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，20（7）：745-755．

劉曉宇．2004．黃瓜霜霉病菌和番茄早疫病菌對嘧菌酯的敏感性基線及抗藥性風(fēng)險評估〔博士論文〕．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)．

劉艷玲，張艷菊，蔡寧，李曉雨．2009．黃瓜霜霉病病原與抗病性研究進展．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，40（4）：127-131．

駱蒙．2001．基于抑制差減雜交方法的小麥抗白粉病相關(guān)基因表達譜研究〔博士論文〕．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院．

牛德．2010．霜霉病菌誘導(dǎo)的黃瓜葉片cDNA文庫構(gòu)建及其表達序列標簽（ESTs）分析〔博士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

喬桂雙．2009．五種Strobilurin類殺菌劑對黃瓜霜霉病菌生物活性及其抗性風(fēng)險〔博士論文〕．保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

石延霞．2002．黃瓜霜霉病菌侵染模擬、致病機理和高溫誘導(dǎo)抗病性的研究〔博士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

王麗娟，牛德，孫彩玉，秦智偉．2010．霜霉病菌侵染的黃瓜葉片cDNA文庫的構(gòu)建及抗病相關(guān)基因篩選．園藝學(xué)報，37（11）：1775-1782．

于秀梅．2006．條銹菌誘導(dǎo)的小麥抑制差減雜交文庫構(gòu)建（SSH）及其表達序列標簽（ESTs）研究〔博士論文〕．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)．

張勝菊，司龍亭．2009．黃瓜霜霉病抗性的遺傳表現(xiàn)與基因效應(yīng)分析．北方園藝，（4）：71-72．

張曉．2008．黃瓜霜霉病菌和番茄早疫病菌對嘧菌酯的抗藥性研究〔博士論文〕．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)．

趙胡．2012．應(yīng)用抑制性差減雜交法分離法分離阜豆苗期根系鎘脅迫誘導(dǎo)表達的基因．生物學(xué)雜志，29（5）：15-18．

朱書生．2005．黃瓜霜霉病菌對氟嗎啉的抗藥性風(fēng)險評估及氟嗎啉作用機制初探〔博士論文〕．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)．

Branca F，Bahcevandziev K，Perticone V，Monteiro A．2005．Sources of resistance to downy mildew〔Peronospora parasitica（Pers．ex Fr．） Fr．〕in Sicilian germplasm of cauliflower and broccoli．Biodiversity and Conservation，14： 841-848．

Diatchenko L，Lau Y F，Campbell A P，Chenchik A，Moqadam F， Huang B，Lukyanov S，Lukyanov K，Gurskaya N，Sverdlov E D，Siebert P D．1996．Suppression subtractive hybridization： a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries．PNAS，93：6025-6030．

Doruchowski R W，Lakowska-Ryk E．1992．Inheritance of resistance to downy mildew （Pseudoperonospora cubensis Berk & Curt） in Cucumis sativus//Doruchowski R W．Proceedings of the Fifth Eucarpia Cucurbitaceae Symposium．Poland：Skierniewice-Warszawa：132-138．

Helena O，Joanna M，Katarzyna N．2011．The genetic basis of resistance to downy mildew in Cucumis spp．—latest developments and prospects．Appl Genet，52（3）： 249-255．

Huang S W，Li R Q，Zhang Z H，Li L，Gu X F，F(xiàn)an W，Lucas W J，Wang X W，Xie B Y，Ni P X，Ren Y Y，Zhu H M，Li J，Lin K，Jin W W，F(xiàn)ei Z J，Li G C，Staub J，Kilian A，Vossen E A G，Wu Y，He J G J，Jia Z Q，Ren Y，Tian G，Lu Y，Ruan J，Qian W B，Wang M W，Huang Q F，Li B，Xuan Z L，Cao J J，Asan，Wu Z G，Zhang J B，Cai QL，Bai Y Q，Zhao B W，Han Y H，Li Y，Li X F，Wang S H，Shi Q X，Liu S Q，Cho W K，Kim J Y，Xu Y，Katarzyna H U，Miao H，Cheng Z C，Zhang S P，Wu J，Yang Y H，Kang H X，Li M，Liang H Q，Ren X L，Shi Z B，Wen M，Jian M，Yang H L，Zhang G J，Yang Z T，Chen R，Liu S F，Li J W，Ma L J，Liu H，Zhou Y，Zhao J，F(xiàn)ang X D，Li G Q，F(xiàn)ang L，Li Y R，Liu D Y，Zheng H K，Zhang Y，Qin N，Li Z，Yang G H，Yang S，Bolund L，Kristiansen K，Zheng H C，Li S C，Zhang X Q，Yang H M，Wang J，Sun R F，Zhang B X，Jiang S Z，Wang J，Du Y C，Li S G．2009．The genome of the cucumber，Cucumis sativus L．．Nature Genetic，41：1275-1281．

Norelli J L，F(xiàn)arrell Jr R E，Bassett C L，Baldo A M，Lalli D A，Aldwinckle H S，Wisniewski M E．2009．Rapid transcriptional response of apple to fire blight disease revealed by cDNA suppression subtractive hybridization analysis．Tree Genetics & Genomes，5（1）：27-40．

Peng G X，Xie L，Hu J，Xia Y X．2009．Identification of genes that are preferentially expressed in conidiogenous cell development of Metarhizium anisopliae by suppression subtractive hybridization．Curr Genet，55：263-271．

Shimizu S，Kanazawa K，Kato A．1963．Studies on the breeding of cucumber for resistance to downy mildew．Part 2．Difference of resistance to downy mildew among the cucumber varieties and the utility of the cucumber variety resistance to downy mildew．Bull Hort Res Sta Jpn，2：80-81．

Taler D，Galperin M，Benjamin I，Cohen Y，Kenigsbuch D．2004．Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease．Plant Cell，16：172-184．

Verica J A，Maximova S N，Strem M D，Carlson J E，Bailey B A，Guiltinan M J．2004． Isolation of ESTs from cacao （Theobroma cacao L．） leaves treated with inducers of the defense response．Plant Cell Rep，23：404-413．

Yang G P，Kuang W W，Weigel R J，Ross D T，Brown P O ．1999．Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes． Nucleic Acids Research，27（6）：1517-1523．

Zhao C J，Wang A R，Shi Y J，Wang L Q，Liu W D，Wang Z H，Lu G D．2008． Identification of defense-related genes in rice responding to challenge by Rhizoctonia solani．Theor Appl Genet，116：501-516．

Using SSH Technology to Identify Relevant Genes Resistant to Cucumber Downy Mildew

LIU Da-jun1，2，QIN Zi-wei1，ZHOU Xiu-yan1，XING Ming1，WU Tao1

（1HorticultureCollege，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China;2HarbinCityAgriculturalInstitute，Harbin150070，Heilongjiang，China）

Adopting SSH technology，this paper studied on the difference expressive genes of downy mildew resistant cucumber inbred line ‘M801-3-1’ before and after the infection of downy mildew．Diseaseresistant cucumber material vaccinated downy mildew and unvaccinated cDNA library was constructed using SSH technology．Forty-eight positive clones were obtained by reverse Northern blot hybridization detection，and 14 UniESTs were obtained including 8 singletons and 6 contigs via molecular biology software．The SSH-EST genes function analysis indicated that oxidative stress resistance and chloroplast reconstruction and protection mechanisms had very important role on disease resistance．At the same time，the paper put forward that Clpb，HSP70，HSP22 and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase might be involved in the R gene-mediated defense reaction，and smHSP might be the ‘defending target’ of R protein，responsible for monitoring intracellular exception．This study has provided a key evidence for revealing the relations between active oxygen mechanism and R gene mediate protection mechanism．

Cucumber; Downy mildew; SSH technology

劉大軍，男，博士研究生，高級農(nóng)藝師，專業(yè)方向：黃瓜育種和菜豆育種，E-mail：jianlongedu@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：秦智偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種，E-mail：zwqin727@163.con

2013-06-28；接受日期：2013-11-15

國家自然科學(xué)基金項目（31272158），“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD02B03），農(nóng)業(yè)部“東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室”項目，黑龍江省寒地蔬菜生物學(xué)重點實驗室項目