丹皮酚對血管性認知障礙小鼠認知功能的保護作用

王浩，耿趙銘，咼登俊，胡智偉，王百辰

（1.浙江省立同德醫院 神經內科，浙江 杭州 310012；2.濰坊醫學院 臨床醫學系，山東 濰坊 261053）

丹皮酚對血管性認知障礙小鼠認知功能的保護作用

王浩1，耿趙銘2，咼登俊1，胡智偉1，王百辰1

（1.浙江省立同德醫院 神經內科，浙江 杭州 310012；2.濰坊醫學院 臨床醫學系，山東 濰坊 261053）

目的：探討丹皮酚對血管性認知障礙（VCI）小鼠認知功能及海馬神經元損傷的影響。方法：雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分為假手術（Sham）組、模型（VCI）組、丹皮酚（Pae）低、中、高劑量治療組，每組12只。采用雙側頸總動脈結扎（2VO）制備小鼠反復缺血再灌注VCI模型，Morris水迷宮檢測小鼠的認知功能，尼氏染色觀察小鼠海馬神經元的形態學變化，比色法檢測海馬SOD活性、MDA和NO含量的變化。結果：VCI小鼠認知功能下降（P＜0.01），海馬CA1區神經元變性壞死，MDA和NO含量增加，SOD活性降低（P＜0.01）；丹皮酚中、高劑量治療可顯著提高VCI小鼠的學習記憶能力，減少VCI所致的海馬CA1區神經元死亡，并降低MDA和NO含量，升高SOD活性（P＜0.05或P＜0.01）。結論：丹皮酚可有效增強VCI小鼠的認知功能，并改善海馬神經元病理改變，可能與其抗氧化應激有關。

認知障礙，血管性；抗氧化；海馬；丹皮酚；小鼠

血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是指各種血管性因素引起的不同程度的認知障礙綜合征，發病率高，起病隱匿并且進行性加重，嚴重影響生活質量[1-2]。VCI與缺血性腦血管病有關，長期慢性腦灌注不足可引起腦組織病理生理改變，進而出現系列功能障礙。目前主要是通過改善循環、促進代謝、增強神經傳遞等改善患者癥狀，但仍缺乏特異有效的治療藥物[3]。而中藥及其活性成分在防治腦缺血損傷及認知損害等方面顯示出良好效果，成為研究熱點[4]。丹皮酚（paeonol，Pae）是一種中藥單體，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤及抗心律失常等藥理作用[11]。本研究旨在觀察Pae對VCI小鼠的神經保護作用，并初步探討其保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 雄性C57BL/6小鼠60只，體質量22～26 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號：0002868，動物許可證號：SCXK（浙）2003-0001。隨機分為假手術（Sham）組，血管性認知障礙模型（VCI）組，Pae低、中、高劑量治療（分別為Pae-L、Pae-M、Pae-H）組，每組12只。

1.2 實驗試劑 Pae（Pae注射液：每支10 mg/2 mL，純度99%，由上海第一生化藥業有限公司提供）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.3 模型建立及給藥方法 采用反復結扎雙側頸總動脈（CCA）造成缺血再灌注損傷（2VO）建立小鼠VCI模型[6-7]。采用10%水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，鈍性分離雙側CCA，用動脈夾夾閉雙側CCA造成腦缺血，夾閉10 min，再灌注20 min，反復3次，縫合切口，術后行抗感染治療。Sham組只行CCA分離，不夾閉血管。治療組術后第1天分別開始腹腔注射10、20、40 mg/kg Pae，每日1次，共28 d；而Sham組和VCI組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液注射。模型篩選標準：排除術后有明顯運動障礙的小鼠，進行Morris水迷宮訓練，取第5天逃避潛伏期進行計算，公式為：（測試小鼠逃避潛伏期-對照組小鼠平均逃避潛伏期）/測試小鼠逃避潛伏期，＞20%為癡呆（其中20%～30%為輕度，30%～40%為中度，＞40%為重度），＜20%者剔除。

1.4 小鼠學習記憶能力測定

1.4.1 定位航行實驗：實驗前將小鼠放入水中進行適應性訓練。術后28 d各組小鼠開始行Morris水迷宮實驗。實驗歷時5 d，每天訓練1次，記錄小鼠尋找并爬上平臺的時間即逃避潛伏期；如果小鼠在120 s內未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，記為120 s。每只小鼠每天分別從4個不同象限放入水中，每個象限各放入1次，計算每天逃避潛伏期的平均值。

1.4.2 空間探索實驗：第6天撤除平臺，任選一個入水點放入小鼠，測量120 s內：①小鼠在目標象限和其他象限的游泳時間；②穿越目標（原平臺）次數[8-9]。

1.5 生化指標檢測 行為學測試結束后，每組6只小鼠斷頭取腦，在冰上迅速分離海馬組織，制成10%組織勻漿，4 ℃ 3 000 r/min，離心10 min，取上清液，根據試劑盒說明書，測定海馬組織SOD活性及MDA和NO的含量。

1.6 病理學觀察 每組另6只小鼠麻醉后行心臟灌流，冰預冷0.9%氯化鈉溶液快速沖洗后序貫以4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛后固定24 h，30%蔗糖脫水3 d，腦組織沉底后用冰凍切片包埋劑（OCT）包埋，進行冰凍切片（10μm），常規尼氏染色，在顯微鏡下觀察海馬CA1區錐體神經元形態學改變。

1.7 統計學處理方法 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。實驗數據以±s表示，組間均數比較用重復測量方差分析，兩兩比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pae對小鼠認知功能的影響

2.1.1 定位航行實驗：隨著訓練次數增多，各組小鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短。與Sham組相比，VCI組小鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；而與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（n=12，±s，s）

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（n=12，±s，s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天Sham組32.06±16.8325.32±14.3320.46±10.5613.43±9.35 9.32±3.91 VCI組80.34±21.50a75.14±9.63a71.21±11.59a65.85±7.32a59.56±9.73a Pae-L組60.86±19.6555.21±11.4148.96±12.6140.28±11.5933.21±8.91 Pae-M組45.21±13.58b37.25±11.37b30.49±8.44b23.25±6.41b20.38±7.25b Pae-H組42.85±14.47b30.25±9.86c26.19±9.37c17.85±5.78c13.51±4.66c

2.1.2 空間探索實驗：與Sham組相比，VCI組穿越目標象限時間明顯縮短（P＜0.01），穿越平臺次數明顯減少（P＜0.01）；與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組穿越目標象限時間明顯延長，穿越平臺次數明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.2 Pae對海馬中SOD活性及MDA和NO含量的影響與Sham組相比，VCI組小鼠海馬中SOD活性明顯降低（P＜0.01），MDA和NO含量顯著升高（P＜0.01）。與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組能夠顯著升高小鼠海馬SOD活性，并降低MDA和NO含量（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

2.3 Pae改善小鼠CA1區海馬神經元損傷 Sham組CA1區海馬錐體神經元數目多，排列整齊且緊密；VCI組小鼠海馬神經元呈現出典型的神經病理性改變，神經元密度顯著減少（P＜0.01），形態不規則，著色不均勻，排列稀疏，并且尼氏小體減少或消失。而與VCI組比較，Pae-M組、Pae-H組的海馬神經元損傷減輕（P＜0.05或P＜0.01），并且排列較整齊，層次較清楚，尼氏小體尚存在（見圖1和表4）。

表2 各組小鼠空間探索實驗結果比較（n=12，±s）

表2 各組小鼠空間探索實驗結果比較（n=12，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別穿越目標象限時間（s）穿越平臺次數Sham組22.37±9.20a8.35±2.56 VCI組10.75±4.92a2.13±0.96a Pae-L組13.83±5.17a3.69±0.85 Pae-M組17.43±5.95b4.65±1.52b Pae-H組19.37±4.99c6.81±1.63c

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性、MDA和NO含量比較（n=6，±s）

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性、MDA和NO含量比較（n=6，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別SOD（U/mg prot）MDA（μmol/g prot）NO（μmol/g prot）Sham組298.26±62.151.38±0.44a8.82±3.22 VCI組190.85±54.33a2.65±0.51a11.95±3.21a Pae-L組202.17±76.322.21±0.92a10.76±4.59 Pae-M組235.89±58.36b1.93±0.85b10.16±2.57b Pae-H組272.71±71.12c1.55±0.62b9.02±2.35b

圖1 Pae對小鼠海馬CAl區錐體神經元損傷的影響（尼氏染色，×400）

表4 各組小鼠海馬CA1區神經元密度比較（n=6，±s）

表4 各組小鼠海馬CA1區神經元密度比較（n=6，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別神經元密度（×103cells/mm2）Sham組1.28±0.25aVCI組0.57±0.14aPae-L組0.62±0.23aPae-M組0.86±0.29bPae-H組1.02±0.28c

3 討論

反復腦缺血再灌注以及長期慢性腦灌注不足是造成VCI的主要原因，而認知功能障礙則是其主要的臨床癥狀[1-2]。本研究采用反復結扎小鼠雙側CCA建立VCI模型，腦組織損傷明顯，并造成學習記憶障礙，較好地模擬了VCI病程[6-7]。本實驗行為學結果顯示，術后28 d模型組小鼠出現明顯的學習記憶障礙，表現為逃離潛伏期的延長和在目標象限中游泳時間的縮短以及穿越平臺次數的減少。海馬是大腦的重要結構之一，是腦內參與記憶貯存功能的重要部分，對缺血、低氧非常敏感，也是VCI研究中涉及最多的腦區之一[5]，本實驗針對海馬進行尼氏染色，結果發現海馬CA1區錐體細胞變性、壞死，神經元密度降低，進一步證明造模成功。

Pae是從毛茛科植物牡丹皮、蘿藦科植物徐長卿的全草等中提取出的小分子酚類單體，呈白色針狀結晶，是一種天然抗氧化劑，其藥理作用十分廣泛，具有良好的應用前景和臨床價值[11-14]。研究表明Pae能夠通過清除氧自由基、抗脂質過氧化、增加腦組織血流量、增加側支循環、抑制Ca2+超載、抗炎等減輕腦缺血再灌注損傷[16-17]，并且能抑制阿爾茨海默病大鼠神經元凋亡，改善糖尿病大鼠認知障礙[18-20]，還能調節小膠質細胞介導的炎癥[15]。通過本研究發現Pae治療后小鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短，在目標象限停留時間以及穿越平臺次數顯著增多，并且抑制海馬CA1區錐體細胞變性、壞死，改善神經元密度的降低，提示Pae具有改善認知功能的作用。結合國內外研究報道，提示丹皮酚可能具有治療腦疾病的應用前景。

VCI與脂質過氧化、氧自由基釋放、Ca2+超載、細胞凋亡和炎癥反應等有關，多種機制相互影響、促進，加重腦組織損傷，而自由基大量生成是神經元損傷的主要因素之一[1-3，10]。本實驗發現Pae治療可明顯降低海馬組織MDA、NO含量，提高SOD活性，表明Pae具有清除腦組織自由基，減少脂質過氧化，從而起到保護神經元的作用。

綜上所述，通過本次實驗發現Pae治療可明顯改善VCI小鼠的認知功能，降低海馬組織MDA、NO含量，提高SOD活性，并且改善海馬CA1區神經元損傷，其作用機制可能與減輕海馬區的氧化應激水平有關。當然針對Pae改善VCI小鼠認知功能的具體機制仍需要進一步研究。

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（本文編輯：吳飛盈）

Protective effects of paeonol on cognitive dysfunctions in mice with vascular cognitive impairment

WANG Hao1, GENG Zhaoming2, GUO Dengjun1, HU Zhiwei1, WANG Baichen1.
1.Department of Neurology, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou, 310012; 2.Department of Clinical Medicine, Weifang Medical College, Weifang, 261053

Objective:To investigate the effects of paeonol on cognitive dysfunctions and hippocampal neuronal injury of vascular cognitive impairment (VCI) mice.Methods:Sixty C57BL/6 mice were randomly divided into sham opertated group, the VCI group and the paeonol treated groups (low, medium and high dose). The VCI models were dupilicated by the bilateral common carotid artery occlusion (2VO). The cognitive impairments were observed by Morris water maze. The contents of MDA, SOD and NO in hippocampus were determined spectrometrically. The hippocampal neuron injuries in the CA1 region were detected by nissle staining.Results:VCI induced the decreased cognitive function and neuron injury in the hippocampal CA1 region (P＜0.01). And MDA and NO contents were signifcantly increased, whereas SOD activity was dramatically decreased after VCI (P＜0.01). Compared with VCI model goup, the medium and high dose of paeonol treatment signifcantly improved cognitive impairments and reduced pathological changes in hippocampal CA1 region (P＜0.05, P＜0.01). In additon, the medium and high dose of paeonol treatment markedly improved SOD activity, decreased MDA and NO contents in hippocampus (P＜0.05, P＜0.01).Conclusion:Paeonol can improve cognitive impairments and neuronal injury in VCI mice, which may be related to the increased antioxidative ability of brain tissue.

cognitive impairment, vascular; antioxidant; hippocampus; paeonol; mice

R741

A

1000-2138（2014）10-0708-04

2014-04-09

浙江省自然科學基金資助項目（Y2110679）。

王浩（1982-），男，山東棗莊人，主治醫師，碩士。

胡智偉，主任醫師，Email：huzhiwei2008@163.com。