硫酸鏈霉素分子印跡傳感器的研究

陳怡等

摘要：基于分子印跡技術，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過循環伏安電聚合在玻碳電極表面構建出對STR具有選擇特異性的電化學傳感器，且制備過程中STR無需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應用于飼料添加劑和動物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過敏反應，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過誘導抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國內外關于鏈霉素檢測的報道主要有基于微生物的檢測法[5]、免疫學檢測法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設備簡單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯免疫法和微生物法易產生假陽性結果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團，往往需要進行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進行檢測，操作繁瑣、耗時長，而且大型設備的使用對操作人員要求較高，檢測成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機溶劑、酸堿等條件下穩定性高的特點[11]，已作為傳感器識別元件應用于環保、生物分析、食品和醫藥等領域，提供定量或半定量檢測分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡便，膜厚可控，特異性強，重現性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現性良好。本實驗以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經電化學聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學傳感器，實驗過程中無需對鏈霉素進行衍生處理，而是間接地通過電化學手段分析，操作簡單快捷，特異性強，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動化的電化學傳感器的研究提供依據。2實驗部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學工作站（天津市蘭力科化學電子高技術有限公司）；三電極系統：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對電極（天津艾達恒晟科技發展有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國生物科技有限責任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學試劑開發中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區間內， 以0.1 V/s的掃速進行循環伏安（CV）掃描，待循環伏安響應穩定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質），通純N2 預聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區間內采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實驗中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印跡技術，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過循環伏安電聚合在玻碳電極表面構建出對STR具有選擇特異性的電化學傳感器，且制備過程中STR無需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應用于飼料添加劑和動物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過敏反應，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過誘導抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國內外關于鏈霉素檢測的報道主要有基于微生物的檢測法[5]、免疫學檢測法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設備簡單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯免疫法和微生物法易產生假陽性結果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團，往往需要進行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進行檢測，操作繁瑣、耗時長，而且大型設備的使用對操作人員要求較高，檢測成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機溶劑、酸堿等條件下穩定性高的特點[11]，已作為傳感器識別元件應用于環保、生物分析、食品和醫藥等領域，提供定量或半定量檢測分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡便，膜厚可控，特異性強，重現性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現性良好。本實驗以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經電化學聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學傳感器，實驗過程中無需對鏈霉素進行衍生處理，而是間接地通過電化學手段分析，操作簡單快捷，特異性強，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動化的電化學傳感器的研究提供依據。2實驗部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學工作站（天津市蘭力科化學電子高技術有限公司）；三電極系統：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對電極（天津艾達恒晟科技發展有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國生物科技有限責任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學試劑開發中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區間內， 以0.1 V/s的掃速進行循環伏安（CV）掃描，待循環伏安響應穩定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質），通純N2 預聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區間內采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實驗中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印跡技術，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過循環伏安電聚合在玻碳電極表面構建出對STR具有選擇特異性的電化學傳感器，且制備過程中STR無需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應用于飼料添加劑和動物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過敏反應，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過誘導抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國內外關于鏈霉素檢測的報道主要有基于微生物的檢測法[5]、免疫學檢測法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設備簡單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯免疫法和微生物法易產生假陽性結果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯質譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團，往往需要進行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進行檢測，操作繁瑣、耗時長，而且大型設備的使用對操作人員要求較高，檢測成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機溶劑、酸堿等條件下穩定性高的特點[11]，已作為傳感器識別元件應用于環保、生物分析、食品和醫藥等領域，提供定量或半定量檢測分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡便，膜厚可控，特異性強，重現性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現性良好。本實驗以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經電化學聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學傳感器，實驗過程中無需對鏈霉素進行衍生處理，而是間接地通過電化學手段分析，操作簡單快捷，特異性強，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動化的電化學傳感器的研究提供依據。2實驗部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學工作站（天津市蘭力科化學電子高技術有限公司）；三電極系統：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對電極（天津艾達恒晟科技發展有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國生物科技有限責任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學試劑開發中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區間內， 以0.1 V/s的掃速進行循環伏安（CV）掃描，待循環伏安響應穩定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質），通純N2 預聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區間內采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實驗中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。