丹酚酸A甲基結合代謝物的制備與結構鑒定

翟文婷等

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉移酶（COMT）活力的大鼠肝細胞液體外溫孵代謝反應，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結合代謝物。HPLC分析結果顯示，這些體外溫孵代謝產物與大鼠經靜脈途徑給予SAA后在體內生成的代謝產物一致。以ODS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產物單體成分。綜合應用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進行波譜數據的對比分析，鑒定這4種甲基結合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結合代謝；結構鑒定；質譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內吸收、分布、代謝和排泄的過程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評價的關鍵指標，并貫穿新藥研發至臨床應用的全過程。在藥物設計及新藥開發早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發的成功率，還是新藥發現和藥物設計的重要來源，受到國際醫藥界的普遍關注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護劑候選藥物進入開發階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環上的3對鄰二酚羥基結構可能導致SAA在體內發生快速且廣泛的代謝轉化， 這一推測已為包括人源重組酶體外溫孵在內的眾多實驗研究結果證實。研究表明，SAA在體內主要經肝臟的兒茶酚氧位甲基轉移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結合在內的多種Ⅱ相結合代謝產物，成為其發揮體內藥效作用的直接物質基礎[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎上，利用富含COMT酶的大鼠肝細胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應體系，結合中壓柱層析技術，分離制備了4種與體內一致的SAA甲基結合代謝物，并綜合應用質譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學結構特征（圖1）。相關研究結果將為揭示SAA的體內代謝過程以及基于活性代謝產物的新藥篩選和發現提供基礎。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括在線脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級桿串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構成HPLCMS聯用分析系統；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國產分析純，實驗用水為超純水。

2.2.3甲基結合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細胞液，Bradford法測定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預孵育5 min，加入SAA溶液，繼續孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應。于終止反應液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮氣流吹干，殘渣復溶，以ODS為固定相，進行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統梯度洗脫，HPLC跟蹤監測，收集、合并保留時間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經HPLC檢測，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進行結構分析。

3結果與討論

3.1代謝物的體內外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測定了空白大鼠肝細胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內源性物質及少量未反應完全的SAA外有4個主要色譜峰（根據色譜出峰先后依次標記為1， 2， 3和4），其色譜保留時間均大于SAA，表明在優化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個極性明顯低于SAA的主要代謝產物。進一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發現除膽汁內源性物質和SAA外尚含有多個代謝產物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個主要色譜峰，且色譜保留時間完全一致，僅在色譜峰的相對高度上有所差異。上述結果表明，建立的以大鼠肝細胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內一致的SAA代謝物，可作為反應體系進行體內代謝物的富集制備。

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉移酶（COMT）活力的大鼠肝細胞液體外溫孵代謝反應，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結合代謝物。HPLC分析結果顯示，這些體外溫孵代謝產物與大鼠經靜脈途徑給予SAA后在體內生成的代謝產物一致。以ODS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產物單體成分。綜合應用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進行波譜數據的對比分析，鑒定這4種甲基結合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結合代謝；結構鑒定；質譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內吸收、分布、代謝和排泄的過程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評價的關鍵指標，并貫穿新藥研發至臨床應用的全過程。在藥物設計及新藥開發早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發的成功率，還是新藥發現和藥物設計的重要來源，受到國際醫藥界的普遍關注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護劑候選藥物進入開發階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環上的3對鄰二酚羥基結構可能導致SAA在體內發生快速且廣泛的代謝轉化， 這一推測已為包括人源重組酶體外溫孵在內的眾多實驗研究結果證實。研究表明，SAA在體內主要經肝臟的兒茶酚氧位甲基轉移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結合在內的多種Ⅱ相結合代謝產物，成為其發揮體內藥效作用的直接物質基礎[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎上，利用富含COMT酶的大鼠肝細胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應體系，結合中壓柱層析技術，分離制備了4種與體內一致的SAA甲基結合代謝物，并綜合應用質譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學結構特征（圖1）。相關研究結果將為揭示SAA的體內代謝過程以及基于活性代謝產物的新藥篩選和發現提供基礎。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括在線脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級桿串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構成HPLCMS聯用分析系統；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國產分析純，實驗用水為超純水。

2.2.3甲基結合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細胞液，Bradford法測定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預孵育5 min，加入SAA溶液，繼續孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應。于終止反應液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮氣流吹干，殘渣復溶，以ODS為固定相，進行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統梯度洗脫，HPLC跟蹤監測，收集、合并保留時間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經HPLC檢測，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進行結構分析。

3結果與討論

3.1代謝物的體內外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測定了空白大鼠肝細胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內源性物質及少量未反應完全的SAA外有4個主要色譜峰（根據色譜出峰先后依次標記為1， 2， 3和4），其色譜保留時間均大于SAA，表明在優化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個極性明顯低于SAA的主要代謝產物。進一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發現除膽汁內源性物質和SAA外尚含有多個代謝產物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個主要色譜峰，且色譜保留時間完全一致，僅在色譜峰的相對高度上有所差異。上述結果表明，建立的以大鼠肝細胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內一致的SAA代謝物，可作為反應體系進行體內代謝物的富集制備。

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉移酶（COMT）活力的大鼠肝細胞液體外溫孵代謝反應，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結合代謝物。HPLC分析結果顯示，這些體外溫孵代謝產物與大鼠經靜脈途徑給予SAA后在體內生成的代謝產物一致。以ODS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產物單體成分。綜合應用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進行波譜數據的對比分析，鑒定這4種甲基結合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結合代謝；結構鑒定；質譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內吸收、分布、代謝和排泄的過程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評價的關鍵指標，并貫穿新藥研發至臨床應用的全過程。在藥物設計及新藥開發早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發的成功率，還是新藥發現和藥物設計的重要來源，受到國際醫藥界的普遍關注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護劑候選藥物進入開發階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環上的3對鄰二酚羥基結構可能導致SAA在體內發生快速且廣泛的代謝轉化， 這一推測已為包括人源重組酶體外溫孵在內的眾多實驗研究結果證實。研究表明，SAA在體內主要經肝臟的兒茶酚氧位甲基轉移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結合在內的多種Ⅱ相結合代謝產物，成為其發揮體內藥效作用的直接物質基礎[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎上，利用富含COMT酶的大鼠肝細胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應體系，結合中壓柱層析技術，分離制備了4種與體內一致的SAA甲基結合代謝物，并綜合應用質譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學結構特征（圖1）。相關研究結果將為揭示SAA的體內代謝過程以及基于活性代謝產物的新藥篩選和發現提供基礎。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括在線脫氣機、二元高壓泵、自動進樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級桿串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構成HPLCMS聯用分析系統；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國產分析純，實驗用水為超純水。

2.2.3甲基結合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細胞液，Bradford法測定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預孵育5 min，加入SAA溶液，繼續孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應。于終止反應液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮氣流吹干，殘渣復溶，以ODS為固定相，進行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統梯度洗脫，HPLC跟蹤監測，收集、合并保留時間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經HPLC檢測，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進行結構分析。

3結果與討論

3.1代謝物的體內外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測定了空白大鼠肝細胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內源性物質及少量未反應完全的SAA外有4個主要色譜峰（根據色譜出峰先后依次標記為1， 2， 3和4），其色譜保留時間均大于SAA，表明在優化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個極性明顯低于SAA的主要代謝產物。進一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發現除膽汁內源性物質和SAA外尚含有多個代謝產物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個主要色譜峰，且色譜保留時間完全一致，僅在色譜峰的相對高度上有所差異。上述結果表明，建立的以大鼠肝細胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內一致的SAA代謝物，可作為反應體系進行體內代謝物的富集制備。