基于蛋白質(zhì)組學(xué)的細(xì)胞色素P450和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶亞型絕對(duì)定量分析

鄒漢法等

摘要：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r>0.995，線性關(guān)系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致，在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結(jié)果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便，更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)； 肝微粒體； 細(xì)胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進(jìn)入體內(nèi)，可以通過(guò)代謝以一種或多種有活性的或無(wú)活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí)，代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細(xì)胞色素P450酶（簡(jiǎn)稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量，對(duì)研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過(guò)去的研究中，常通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過(guò)程受多種因素的影響，因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平； 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應(yīng)，這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，影響因素多，所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過(guò)對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 （圖1A）；然后對(duì)[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析，需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過(guò)MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應(yīng)值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定

摘要：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r>0.995，線性關(guān)系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致，在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結(jié)果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便，更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)； 肝微粒體； 細(xì)胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進(jìn)入體內(nèi)，可以通過(guò)代謝以一種或多種有活性的或無(wú)活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí)，代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細(xì)胞色素P450酶（簡(jiǎn)稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量，對(duì)研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過(guò)去的研究中，常通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過(guò)程受多種因素的影響，因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平； 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應(yīng)，這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，影響因素多，所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過(guò)對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 （圖1A）；然后對(duì)[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析，需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過(guò)MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應(yīng)值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定

摘要：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r>0.995，線性關(guān)系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致，在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結(jié)果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便，更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)； 肝微粒體； 細(xì)胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進(jìn)入體內(nèi)，可以通過(guò)代謝以一種或多種有活性的或無(wú)活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí)，代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細(xì)胞色素P450酶（簡(jiǎn)稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量，對(duì)研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過(guò)去的研究中，常通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過(guò)程受多種因素的影響，因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平； 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應(yīng)，這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，影響因素多，所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過(guò)對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 （圖1A）；然后對(duì)[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析，需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過(guò)MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應(yīng)值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定