超氧陰離子自由基電化學分析的新進展

王振+張立敏+田陽

摘要：超氧陰離子自由基（O·-2）是分子氧在生物體內氧化還原反應中產生的活性中間體，其動態變化可以提供豐富的生理、病理信息。因此，實時、在體檢測O·-2自由基的分析方法越來越受到人們的關注。電化學分析方法具有直觀、簡單、易微型化等優點，在O·-2自由基檢測中得到了廣泛的應用。本文從溶液/電極界面的設計入手，利用酶的直接電子傳遞，結合O·-2自由基的分析特性，簡要評述了近幾年電化學分析在細胞和活體內O·-2自由基檢測方面的研究進展。

關鍵詞：超氧陰離子自由基； 活體； 電化學分析； 直接電子傳遞； 酶； 綜述

1引言

作為新陳代謝的活性中間體，正常狀態下O·-2自由基在生物體中保持相對穩定的動態平衡。細胞自身的細胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以將O·-2自由基轉化為無害物質進行自我修復，這一系列的過程對細胞增殖、凋亡、損傷具有重要的影響，并在細胞信號轉導過程中起著十分重要的作用。當細胞受到外界刺激或發生病變過程中會產生過量O·-2自由基，使得細胞產生氧化應激，引起癌癥、神經性疾病、帕金森病等生理病變[1～5]，從而對細胞的生理和病理功能產生重要的影響。因此，檢測生物體中O·-2自由基的濃度具有十分重要的現實意義。

然而，因為O·-2自由基具有氧化活性高、體內濃度低、壽命短等特點，所以需要發展原位、實時、活體的O·-2自由基檢測方法。電化學方法具有操作簡單、易微型化、靈敏度高、易于原位、實時、在體檢測等優點而備受關注，其中，基于酶傳感器的電化學分析方法最為引人注目[6～11]。2溶液/電極界面的設計及酶的直接電子傳遞

2.1溶液/電極界面的設計

針對O·-2自由基的電化學分析，對溶液/電極界面進行設計以改善和提高電極的分析性能是一個極其關鍵的問題[12～16]。酶自身體積較大，而活性中心通常都深埋在其內部，從而加大了活性中心到電極表面的電子傳遞距離，不利于實現直接電子傳遞。第二代酶傳感器采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，但存在媒介體的流失和干擾大的缺陷，給O·-2自由基的準確測定帶來干擾，從而極大限制了其實際應用。第三代酶傳感器的開發使這個領域向前邁進了一大步。通過界面設計優化，利用酶的直接電子傳遞機理克服了原先的不足，能夠實現細胞或生物體中O·-2自由基的直接檢測。界面設計優化是人為地設計電極表面微結構和其界面反應，通過將酶固定在電極表面上，使暴露的電活性中心更接近電極表面，實現酶與電極之間快速的電子傳遞，達到預期檢測的目標。

2.1.1分子設計分子自組裝是對固體表面進行修飾最為有效的手段之一。高度有序、結構可控、定向密集的穩定分子層為保持酶蛋白質的天然結構和構象提供理想的微環境。同時，單分子作為加快電子傳遞的促進劑，可以用于探索電極表面分子微結構和宏觀電化學響應之間的關系。巰基化物在金屬表面自組裝是目前研究得最廣泛、最深入的一類物質。其自組裝膜有序性強，不易聚合，條件控制容易等優點擴展其在傳感方面研究和應用的范圍。 Tian等[17]在金電極表面自組裝一層巰基半胱氨酸單分子膜來考察溶液中SOD的電化學活性，同時以裸金電極作為對比，實驗結果證實SOD能夠固定于分子修飾電極的表面上，使得電極反應更容易實現，這可能由于半胱氨酸在界面自發形成的一種熱力學穩定分子層，更有利于實現SOD“軟著陸”。隨后，他們又將3種SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分別固定在巰基半胱氨酸修飾的金電極界面上，首次同時實現3種SOD的直接電子傳遞；巰基半胱氨酸作為促進劑加快電子的傳遞。通過分子設計在界面上自組裝單分子體系考察電子轉移過程，為更深層次的分子設計和功能組裝反饋信息[18]。

此外，作為一種常用的選擇性結合組氨酸標記蛋白質的方式，次氮基三乙酸/組氨酸（NTA/HT）技術成為組氨酸結合最成功的模版。其將蛋白質定向有序固定在電極表面上，并加快電子傳遞。Jolnson等[19]利用該通用模版技術成功將蛋白質固定在金電極表面上，通過大環效應使NTA衍生物的三氮雜環與金屬離子穩定反應，使得該體系具有更高的穩定性。

摘要：超氧陰離子自由基（O·-2）是分子氧在生物體內氧化還原反應中產生的活性中間體，其動態變化可以提供豐富的生理、病理信息。因此，實時、在體檢測O·-2自由基的分析方法越來越受到人們的關注。電化學分析方法具有直觀、簡單、易微型化等優點，在O·-2自由基檢測中得到了廣泛的應用。本文從溶液/電極界面的設計入手，利用酶的直接電子傳遞，結合O·-2自由基的分析特性，簡要評述了近幾年電化學分析在細胞和活體內O·-2自由基檢測方面的研究進展。

關鍵詞：超氧陰離子自由基； 活體； 電化學分析； 直接電子傳遞； 酶； 綜述

1引言

作為新陳代謝的活性中間體，正常狀態下O·-2自由基在生物體中保持相對穩定的動態平衡。細胞自身的細胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以將O·-2自由基轉化為無害物質進行自我修復，這一系列的過程對細胞增殖、凋亡、損傷具有重要的影響，并在細胞信號轉導過程中起著十分重要的作用。當細胞受到外界刺激或發生病變過程中會產生過量O·-2自由基，使得細胞產生氧化應激，引起癌癥、神經性疾病、帕金森病等生理病變[1～5]，從而對細胞的生理和病理功能產生重要的影響。因此，檢測生物體中O·-2自由基的濃度具有十分重要的現實意義。

然而，因為O·-2自由基具有氧化活性高、體內濃度低、壽命短等特點，所以需要發展原位、實時、活體的O·-2自由基檢測方法。電化學方法具有操作簡單、易微型化、靈敏度高、易于原位、實時、在體檢測等優點而備受關注，其中，基于酶傳感器的電化學分析方法最為引人注目[6～11]。2溶液/電極界面的設計及酶的直接電子傳遞

2.1溶液/電極界面的設計

針對O·-2自由基的電化學分析，對溶液/電極界面進行設計以改善和提高電極的分析性能是一個極其關鍵的問題[12～16]。酶自身體積較大，而活性中心通常都深埋在其內部，從而加大了活性中心到電極表面的電子傳遞距離，不利于實現直接電子傳遞。第二代酶傳感器采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，但存在媒介體的流失和干擾大的缺陷，給O·-2自由基的準確測定帶來干擾，從而極大限制了其實際應用。第三代酶傳感器的開發使這個領域向前邁進了一大步。通過界面設計優化，利用酶的直接電子傳遞機理克服了原先的不足，能夠實現細胞或生物體中O·-2自由基的直接檢測。界面設計優化是人為地設計電極表面微結構和其界面反應，通過將酶固定在電極表面上，使暴露的電活性中心更接近電極表面，實現酶與電極之間快速的電子傳遞，達到預期檢測的目標。

2.1.1分子設計分子自組裝是對固體表面進行修飾最為有效的手段之一。高度有序、結構可控、定向密集的穩定分子層為保持酶蛋白質的天然結構和構象提供理想的微環境。同時，單分子作為加快電子傳遞的促進劑，可以用于探索電極表面分子微結構和宏觀電化學響應之間的關系。巰基化物在金屬表面自組裝是目前研究得最廣泛、最深入的一類物質。其自組裝膜有序性強，不易聚合，條件控制容易等優點擴展其在傳感方面研究和應用的范圍。 Tian等[17]在金電極表面自組裝一層巰基半胱氨酸單分子膜來考察溶液中SOD的電化學活性，同時以裸金電極作為對比，實驗結果證實SOD能夠固定于分子修飾電極的表面上，使得電極反應更容易實現，這可能由于半胱氨酸在界面自發形成的一種熱力學穩定分子層，更有利于實現SOD“軟著陸”。隨后，他們又將3種SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分別固定在巰基半胱氨酸修飾的金電極界面上，首次同時實現3種SOD的直接電子傳遞；巰基半胱氨酸作為促進劑加快電子的傳遞。通過分子設計在界面上自組裝單分子體系考察電子轉移過程，為更深層次的分子設計和功能組裝反饋信息[18]。

此外，作為一種常用的選擇性結合組氨酸標記蛋白質的方式，次氮基三乙酸/組氨酸（NTA/HT）技術成為組氨酸結合最成功的模版。其將蛋白質定向有序固定在電極表面上，并加快電子傳遞。Jolnson等[19]利用該通用模版技術成功將蛋白質固定在金電極表面上，通過大環效應使NTA衍生物的三氮雜環與金屬離子穩定反應，使得該體系具有更高的穩定性。

摘要：超氧陰離子自由基（O·-2）是分子氧在生物體內氧化還原反應中產生的活性中間體，其動態變化可以提供豐富的生理、病理信息。因此，實時、在體檢測O·-2自由基的分析方法越來越受到人們的關注。電化學分析方法具有直觀、簡單、易微型化等優點，在O·-2自由基檢測中得到了廣泛的應用。本文從溶液/電極界面的設計入手，利用酶的直接電子傳遞，結合O·-2自由基的分析特性，簡要評述了近幾年電化學分析在細胞和活體內O·-2自由基檢測方面的研究進展。

關鍵詞：超氧陰離子自由基； 活體； 電化學分析； 直接電子傳遞； 酶； 綜述

1引言

作為新陳代謝的活性中間體，正常狀態下O·-2自由基在生物體中保持相對穩定的動態平衡。細胞自身的細胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以將O·-2自由基轉化為無害物質進行自我修復，這一系列的過程對細胞增殖、凋亡、損傷具有重要的影響，并在細胞信號轉導過程中起著十分重要的作用。當細胞受到外界刺激或發生病變過程中會產生過量O·-2自由基，使得細胞產生氧化應激，引起癌癥、神經性疾病、帕金森病等生理病變[1～5]，從而對細胞的生理和病理功能產生重要的影響。因此，檢測生物體中O·-2自由基的濃度具有十分重要的現實意義。

然而，因為O·-2自由基具有氧化活性高、體內濃度低、壽命短等特點，所以需要發展原位、實時、活體的O·-2自由基檢測方法。電化學方法具有操作簡單、易微型化、靈敏度高、易于原位、實時、在體檢測等優點而備受關注，其中，基于酶傳感器的電化學分析方法最為引人注目[6～11]。2溶液/電極界面的設計及酶的直接電子傳遞

2.1溶液/電極界面的設計

針對O·-2自由基的電化學分析，對溶液/電極界面進行設計以改善和提高電極的分析性能是一個極其關鍵的問題[12～16]。酶自身體積較大，而活性中心通常都深埋在其內部，從而加大了活性中心到電極表面的電子傳遞距離，不利于實現直接電子傳遞。第二代酶傳感器采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，但存在媒介體的流失和干擾大的缺陷，給O·-2自由基的準確測定帶來干擾，從而極大限制了其實際應用。第三代酶傳感器的開發使這個領域向前邁進了一大步。通過界面設計優化，利用酶的直接電子傳遞機理克服了原先的不足，能夠實現細胞或生物體中O·-2自由基的直接檢測。界面設計優化是人為地設計電極表面微結構和其界面反應，通過將酶固定在電極表面上，使暴露的電活性中心更接近電極表面，實現酶與電極之間快速的電子傳遞，達到預期檢測的目標。

2.1.1分子設計分子自組裝是對固體表面進行修飾最為有效的手段之一。高度有序、結構可控、定向密集的穩定分子層為保持酶蛋白質的天然結構和構象提供理想的微環境。同時，單分子作為加快電子傳遞的促進劑，可以用于探索電極表面分子微結構和宏觀電化學響應之間的關系。巰基化物在金屬表面自組裝是目前研究得最廣泛、最深入的一類物質。其自組裝膜有序性強，不易聚合，條件控制容易等優點擴展其在傳感方面研究和應用的范圍。 Tian等[17]在金電極表面自組裝一層巰基半胱氨酸單分子膜來考察溶液中SOD的電化學活性，同時以裸金電極作為對比，實驗結果證實SOD能夠固定于分子修飾電極的表面上，使得電極反應更容易實現，這可能由于半胱氨酸在界面自發形成的一種熱力學穩定分子層，更有利于實現SOD“軟著陸”。隨后，他們又將3種SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分別固定在巰基半胱氨酸修飾的金電極界面上，首次同時實現3種SOD的直接電子傳遞；巰基半胱氨酸作為促進劑加快電子的傳遞。通過分子設計在界面上自組裝單分子體系考察電子轉移過程，為更深層次的分子設計和功能組裝反饋信息[18]。

此外，作為一種常用的選擇性結合組氨酸標記蛋白質的方式，次氮基三乙酸/組氨酸（NTA/HT）技術成為組氨酸結合最成功的模版。其將蛋白質定向有序固定在電極表面上，并加快電子傳遞。Jolnson等[19]利用該通用模版技術成功將蛋白質固定在金電極表面上，通過大環效應使NTA衍生物的三氮雜環與金屬離子穩定反應，使得該體系具有更高的穩定性。