ROCK抑制劑Y-27632對TGF-β1介導的A549細胞上皮—間質轉化的抑制作用

李 巖，吳愛萍，周海英，呂 錚，高 楊，任淑華

(1唐山市工人醫院，河北唐山063000;2河北聯合大學基礎醫學院)

肺癌是常見的惡性腫瘤，其發病率及病死率很高，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的70%～80%，且70%以上的患者確診時已失去手術機會，即使采用放、化療等綜合治療仍不能提高其生存率。最近研究表明，上皮—間質轉化(EMT)可能在腫瘤的發生、發展(尤其是侵襲和轉移)中發揮重要的調控作用，其可能是腫瘤侵襲和轉移的始動因素，且與腫瘤干細胞、腫瘤放化療抵抗和耐藥密切相關［1］。Ras同源物GTP酶(Rho)信號與腫瘤的侵襲和轉移關系密切，現已證實，其下游特征性效應器Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)參與細胞的收縮、遷移、增殖和凋亡等過程［2，3］。2012年，我們觀察了ROCK阻斷劑Y-27632對轉化生長因子-β1(TGF-β1)介導的NSCLC A549細胞EMT的調節作用，旨在探討Y-27632對TGF-β1介導的A549細胞EMT的抑制作用，為開發新的腫瘤抑制藥物Y-27632提供一定的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC A549細胞購自中科院上海細胞庫，Y-27632購自Cayman chemica公司，TGF-β1購自Peprotech公司;E-鈣黏蛋白一抗、波形蛋白一抗、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗、ROCK-I一抗購自Epitomics公司;血清應答因子(SRF)一抗、心肌相關轉錄因子-A(MATF-A)一抗購自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞誘導與分組 A549細胞常規培養并傳代，待細胞密度為60%左右時進行實驗。實驗分為3組，對照組在含0.2%FBS的DMEM培養條件下進行實驗;TGF-β1組在含0.2%FBS的DMEM培養條件下，加入5 ng/mL的TGF-β1誘導;Y-27632組在含0.2%FBS的DMEM培養條件下，先給予Y-27632 10 μmol預孵育1 h，再加入5 ng/mL的TGF-β1誘導［4］。在倒置顯微鏡下進行細胞形態觀察并拍照。

1.2.2 劃痕實驗檢測細胞遷移 將細胞按2× 104/孔種植于24孔板，待次融合狀態后，用200μL槍頭在其孔中央輕輕劃痕，每組8孔，48 h后在倒置顯微鏡下進行細胞形態觀察并拍照。采用IPP 6.0圖像分析軟件測算劃痕區面積，計算遷移率，遷移率越高，遷移能力越強。

1.2.3 免疫細胞化學染色檢測波形蛋白、α-SMA表達 常規制備細胞爬片［5］，采用枸櫞酸鹽高壓熱修復，波形蛋白一抗、α-SMA一抗稀釋比例為1∶300，4℃過夜;二抗37℃孵育20 min，鏡下控制DAB顯色，輕度復染。

1.2.4 Western blot法檢測E-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-SMA、ROCK、SRF、MATF-A表達 采用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，BCA法檢測各蛋白水平，按照50μg/泳道上樣，常規行電泳及電轉。一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，行BCIP/NET顯色，至出現明顯條帶后用純水終止。采用IPP 6.0圖像分析軟件計算條帶平均光密度值(OD)，經內參平衡后作為蛋白的定量分析。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，進行完全隨機設計的單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組EMT 中A549細胞的形態變化和遷移率比較 對照組作用48 h后，A549細胞形態未見明顯變化，細胞連接緊密，折光性強。TGF-β1組誘導48 h后，A549細胞形態由原來的鋪路石樣變為長梭樣或紡錘體形，細胞連接消失，間隔增大，細胞間呈離散趨勢，并隨時間延長而變化顯著。Y-27632組干預后能顯著抑制上述A549細胞變化，細胞形態基本保持原來形態，細胞間具有折光性強的細胞連接，細胞相互融合，呈鋪路石樣。3組A549細胞遷移率比較見表1。

表1 各組EMT中A549細胞遷移率比較(%，±s)

表1 各組EMT中A549細胞遷移率比較(%，±s)

注:與對照組同期比較，*P＜0.05;與TGF-β1組同期比較，#P＜0.05

組別A549細胞遷移率24 h 48 h對照組30.33±5.09 64.17±4.88 TGF-β1組 60.83±5.27* 87.67±3.33* Y-27632組 41.83±4.02# 77.17±3.43#

2.2 3組EMT中A549細胞的波形蛋白、α-SMA、E-鈣黏蛋白表達比較 免疫細胞化學染色顯示，對照組無波形蛋白、α-SMA陽性表達，TGF-β1組可見波形蛋白、α-SMA陽性表達，Y-27632組能抑制波形蛋白、α-SMA陽性表達。Western blot檢測顯示，與對照組比較，TGF-β1組E-鈣黏蛋白表達下調，波形蛋白、α-SMA表達上調(P均＜0.05)。與TGF-β1組比較，Y-27632組E-鈣黏蛋白表達上調，波形蛋白、α-SMA表達下調，分別是TGF-β1組的52.05%、55.65%(P均＜0.05)。見表2。

表2 3組EMT中A549細胞各蛋白表達水平比較(OD，±s)

表2 3組EMT中A549細胞各蛋白表達水平比較(OD，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與TGF-β1組比較，#P＜0.05

組別 E-鈣黏蛋白 波形蛋白 α-SMA ROCK SRF MATF-A對照組 0.48±0.04 0.25±0.06 0.80±0.20 0.18±0.03 0.36±0.11 0.25±0.04 TGF-β1組 0.19±0.06* 0.73±0.19* 2.48±0.56* 0.66±0.24* 0.83±0.09* 0.84±0.27* Y-27632組 0.38±0.09# 0.38±0.09# 1.38±0.30# 0.29±0.03# 0.46±0.14# 0.37±0.03#

2.3 3組EMT中A549細胞ROCK、SRF、MATF-A表達比較 Western blot法檢測結果顯示，TGF-β1組能活化ROCK、SRF、MATF-A表達，其表達分別是對照組的3.67、2.31和3.36倍，差異有統計學意義(P均＜0.05);而Y-27632組則能下調ROCK、SRF、MATF-A表達，其表達分別是 TGF-β1組的0.44、0.55和0.44倍，差異有統計學意義(P均＜0.05)。

3 討論

目前研究認為，EMT是腫瘤上皮細胞浸潤、轉移的重要機制，是上皮細胞獲得運動、遷移能力的主要調控手段。EMT的主要特征為上皮標記物如E-鈣黏蛋白等表達缺失或異位表達，而間質標記物如波形蛋白、α-SMA等出現或表達上調;上皮細胞失去原有極性，由頂—底極性變為前—后極性，即具有遷移的能力;體外培養可見上皮細胞由鋪路石樣變為梭形的成纖維細胞樣形態，伴有偽足形成［6］。本研究發現，TGF-β1誘導后A549細胞連接消失，細胞形態由鋪路石樣變為長梭形，同時遷移能力提高，E-鈣黏蛋白表達下調，波形蛋白、α-SMA表達上調，與文獻報道［6］相似，提示TGF-β1能顯著促進A549細胞發生EMT。

有研究顯示，ROCK在誘導細胞張力纖維絲形成中發揮重要的調控作用，其能促進球狀肌動蛋白(G-actin)聚合為纖維狀肌動蛋白，解聚MATF-A與G-actin的復合物，促進 MATF-A轉位入核，作為SRF的轉錄輔因子，促進其轉錄調控作用，并促進其靶基因α-SMA轉錄［7］。在腫瘤細胞中，SRF過表達能使腫瘤上皮細胞獲得間質表型，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲;基因沉默或下調SRF表達能抑制腫瘤細胞的遷移力、侵襲力和運動力［8，9］;針對SRF及其轉錄輔因子MRTF-A的siRNA能通過下調細胞的擴散、黏附和運動能力，減少腫瘤細胞的惡性潛能［10］。提示ROCK介導的SRF/MATF-A轉錄調控可能是腫瘤細胞發生EMT的重要機制之一，阻斷ROCK可能對EMT發生具有一定抑制作用。

目前研究發現，Y-27632具有多種藥理學作用，包括平喘、降壓、抗炎，以及對缺血再灌注損傷、神經系統疾患的抑制作用，其對腫瘤細胞的凋亡、黏附、遷移也有抑制作用［4，11］。本研究顯示，Y-27632干預后能通過阻斷ROCK/SRF/MATF-A調控的間質表型表達，抑制TGF-β1介導的A549細胞的EMT進程，提示Y-27632可能具有潛在抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的作用。

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