應用六重PCR方法對豬流產死胎病原的快速檢測

梁海英，曾智勇，王偉丞，湯德元，劉 釗

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

母豬繁殖障礙性疾病是以母豬流產，產死胎、木乃伊胎、弱仔和畸形胎等為主要癥狀，其原因主要有兩類：一類是非傳染性因素，約占60%～70%；另一類是傳染性因素，約占30%～40%[1]。在引起母豬繁殖障礙性疫病的傳染性因素中，病毒性因素是目前最為主要的，如豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、乙型腦炎病毒（JEV）和豬細小病毒（PPV）等，這些病毒所致疾病癥狀相似[2]，都可以通過胎盤傳播而感染胎兒，從而影響胎兒的生長和發育。為了盡量降低生產中由此帶來的損失，建立上述病原的快速準確的檢測方法尤其重要。

2014年8月3日，貴陽市某豬場初產母豬發生一起產死胎、弱仔的現象（圖1），為確診病原感染類型，實驗選用了豬繁殖障礙性病毒性疫病六重PCR檢測方法[3]，對該死胎病料進行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CFSV 和 JEV感染情況的快速檢測?，F將診斷過程報道如下。

圖1 產死胎、弱仔的母豬

1 材料與方法

1.1 病料

貴州貴陽市某豬場送檢的1頭死胎。

1.2 參考序列與主要試劑

根 據NCBI公 布PRV gE（NC-006151）、PPV NS1（NC-001718）、PCV2 ORF2 (NC-005148）、PRRSV ORF5 (NC-001961)、CSFV E2（X87939）、JEV E(M55506)序列設計多重PCR引物；核酸提取試 劑 盒；PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0。

1.3 引物的設計與合成

設計了檢測PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV的6對引物，預期的擴增目的片段長度為178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp 和1 015 bp[3]。引物送上海生物工程有限公司合成。

1.4 病料處理

采集送檢死胎的肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結等組織置于乳缽中，剪碎后用PBS按1：5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80 ℃反復凍融3次，8 000 r/min離心15 min，取上清于 -20 ℃保存備用。

1.5 病料中DNA/RNA的抽提

嚴格按TaKaRa公司核酸提取試劑盒說明書提取病料中的核酸[3]。

1.6 多重PCR反應

以病料核酸為模版進行多重PCR擴增。反應體系為50μL， 2×one Step Buffer 25μL， 核 酸 模 版 5μL，Prime Script one Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1μL，共6對引物，RNase Free H2O 6μL。反應條件：50℃ 40 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s ，57 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

應用已建立的六重PCR檢測技術，對送檢病料進行快速檢測，擴增出了178 bp和353 bp左右大小的特異性條帶（圖2），結果表明送檢死胎同時感染有PRV和PCV2兩種病毒。據場主介紹，該豬場只進行過豬瘟、藍耳病和口蹄疫疫苗的接種免疫，即該豬場未曾免疫PRV和PCV2疫苗。根據實驗室病檢測結果，結合流行病學分析，初步判斷該母豬產死胎和弱仔的主要原因系這2種病毒混合感染所致，其中偽狂犬病病毒起主要作用。

PRV主要危害母豬和仔豬，感染種豬和所生仔豬可長期帶毒，健康豬與發病豬或帶毒豬直接接觸可發生感染，引進帶毒種豬是疫情擴散的主要原因。妊娠母豬感染PRV后?？稍斐纱怪眰鞑ナ共《厩秩胩?，從而造成母豬流產和產死胎。目前，疫苗預防是防控PRV的主要措施，由于PRV只有1種血清型，使用疫苗可以控制該病的發生，應用最廣泛的是PRV gE基因缺失疫苗，該疫苗效果較好，同時也方便實驗室進行疫苗毒和野毒感染的鑒別診斷，因此建議規?；i場所有母豬和種公豬都要接種PRV gE基因缺失疫苗。

圖2 病料多重PCR擴增產物電泳結果

PCV2的主要傳染源是病豬和帶毒豬，水平傳播是PCV2在豬群中傳播的方式之一，此外，懷孕母豬感染PCV2后，也可經胎盤垂直傳染給仔豬，并導致繁殖障礙。本次檢測結果也再次表明PCV2是可經胎盤垂直感染的，提示種豬場應做好母豬的PCV2的免疫預防，這對控制仔豬圓環病毒2型感染尤為重要。自2006年PCV2疫苗商品化以來，疫苗免疫也是防控該病最重要的手段。PCV2疫苗的應用在一定程度上有效控制了PCV2感染，顯著降低PCV2感染豬群的臨床癥狀和提高豬的生長性能，但疫苗免疫不能完全阻斷PCV2傳播，也不能清除體內已感染的病毒。因此規模化豬場除免疫PCV2疫苗外，還需強化生物安全，加強飼養管理，改善豬場環境等這些基本措施。

[1] 王守棟，肖建森，曾勇慶，等. 母豬繁殖障礙的原因分析及綜合防制[J]. 養豬，2013(2)： 45-48.

[2] 李春燕，王洪光，湯德元，等. 規?；i場常見豬繁殖障礙病毒性疫病混合感染及其防制研究[J]. 豬業科學，2013，30(10)： 89-91.

[3] 劉志杰，曾智勇，湯德元，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應用[J].畜牧獸醫學報 ，2012，43(9)：1429-1436.