參黃液對大鼠肢體動脈缺血治療作用的初步研究

劉振川，孫 巖 ，何玉祥，劉 洋 ，周 華 ，王茂華，袁 海 ，金 星

近年來，下肢動脈缺血性疾病的發病率逐年上升，已經成為引起肢體壞疽甚至下肢截肢的主要原因之一，嚴重影響患者健康［1-2］。如何有效改善下肢血供，降低下肢缺血性疾病的截肢率，改善患者的生活質量，是血管外科目前面臨的重要課題。筆者所在科室多年來將自行配制的中藥藥液——參黃液應用于下肢缺血性疾病的治療，主要外用于壞疽肢端和缺血肢體的局部。本研究通過動物實驗進一步觀察參黃液對肢體缺血性疾病的治療效果，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠90只［由山東大學醫學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(17/11)20120003］，8 周齡，體重250 ～300 g。

1.2 試藥與試劑

1.2.1 參黃液的配制:將丹參、丹皮、黃檗、苦參、黃連按一定比例用75%乙醇浸泡1周后待用。

1.2.2 試劑:月桂酸(Sigma Aldrich)。生物素化二抗工作液(過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素染色試劑盒):山羊多抗，通用型SP Kit工作液，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，產品編號:SP-9002。血管內皮生長因子(VEGF)一抗:小鼠多抗，Santa Cruz Biotechnology公司生產，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，產品編號:SC-7269。

1.3 方法

1.3.1 造模與分組:采用日本學者Ashida等［3］的方法復制后肢缺血大鼠模型，具體方法:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3．5 ml/kg)進行麻醉，在顯微鏡輔助下行后肢股動脈穿刺，注入月桂酸0．2 ml(濃度10 mg/ml)。給藥后大鼠后肢逐漸出現腫脹、皮色皮溫改變、壞疽等表現，表明造模成功。將造模成功后的90只大鼠隨機分為空白對照組(A組)、75%乙醇治療組(B組)及參黃液治療組(C組)，每組30只。3組一般資料比較差異無統計學意義(P ＞0．05)，具有可比性。

1.3.2 治療方法:造模后立即開始給藥處理［4］。A組不做任何處理，B組用75%乙醇浸泡造模側后肢，早晚各1次，每次15 min;C組用參黃液浸泡造模側后肢，早晚各1次，每次15 min。

1.4 觀察指標

1.4.1 肢體缺血程度評價:造模后第21天，觀察大鼠造模側后肢的皮色、皮溫、動脈搏動情況，以及患肢有無腫脹、繼發感染、壞疽和木乃伊化，并將觀察結果分組詳細記錄。肢體缺血程度評分標準［5］:肢體正常，無缺血為0分;趾端蒼白或行走姿態異常為1分;出現壞疽，但壞疽范圍不超過半足，且肢體其他部位無壞疽為2分;出現壞疽但壞疽范圍不超過半足，且伴有肢體其他部位壞疽為3分;肢體壞疽范圍超過半足為4分;壞疽范圍超過膝(肘)關節為5分。

1.4.2 平均微血管密度(MVD)測定:造模后第21天處死大鼠并留取造模側后肢肌肉標本，對所有標本進行MVD檢測，CD34標記血管內皮，計數MVD采用Weidner［6］方法:在40倍光鏡下掃查整個切片，尋找血管高密度區(熱點)，在400倍視野下計數3個視野被染成棕色的血管數，取平均值作為MVD值。

1.4.3 血管內皮生長因子(VEGF)檢測:應用免疫組化SABC法檢測VEGF相關抗原的表達情況，其陽性表達為肌肉細胞內出現棕黃色顆粒［7］。利用免疫組化圖像分析系統對組織切片進行圖像分析，每例選5張組織切片，首先于低倍鏡下找出5個著色最深的區域(熱點)，再對這些區域進行數字圖像處理，測出積分光密度后取平均值。

1.5 統計學方法 應用SPSS 15．0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗;等級計數資料比較采用秩和檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 肢體缺血程度比較 C組肢體缺血程度與A、B組比較明顯減輕，差異有統計學意義(Z=－2．672，P=0．002;Z= －1．985，P=0．021)，A、B組間比較差異無統計學意義(Z=－0．677，P=0．239)。見表 1。

表1 3組大鼠肢體缺血程度評分結果

2.2 MVD比較 免疫組化毛細血管染色在高倍鏡(400×)下觀察得到 A、B、C組標本 MVD分別為(4．00 ±1．31)、(4．00 ±1．11)、(5．00 ±1．23)根。C組MVD明顯高于A、B組，差異有統計學意義(t=2．135，P=0．031;t=2．067，P=0．026)，但 A、B 組間比較差異無統計學意義(t=0．002，P=5．127)。

2.3 VEGF陽性表達比較 3組造模側后肢內收肌標本均可檢測到VEGF蛋白的陽性表達，C組表達呈強陽性，B組表達較C組弱，A組幾乎無表達(圖1～3)。圖像分析顯示，A、B、C組積分光密度分別為6401．11 ±397．22、6345．96 ±406．50、6719．61 ±323．84，C組高于 A、B組，差異有統計學意義(t=2．601，P=0．022;t=2．733，P=0．021)，A、B 組間比較差異無統計學意義(t=0．001，P=8．235)。

3 討論

近年來，隨著高血壓病、冠心病、高脂血癥的發病率不斷升高，隨之由動脈粥樣硬化引起的下肢缺血性疾病也逐漸增多，已成為下肢缺血性壞疽甚至截肢的主要原因之一［2］。肢端壞疽是糖尿病晚期的嚴重并發癥，也成為下肢截肢的重要因素。在有大量吸煙史的青壯年人群中，血栓閉塞性脈管炎(TAO)是導致其截肢的最常見血管疾病［8］。此外，急性動脈栓塞若治療不及時，亦可導致肢體壞死甚至截肢［1］。

圖1 3組大鼠造模側后肢內收肌標本血管內皮生長因子的表達(SABC法×100)

如何改善肢體缺血癥狀，避免肢端壞疽造成的截肢是血管外科目前面臨的難點和研究熱點。臨床常用的治療手段有藥物治療、手術治療、介入治療、基因治療和干細胞移植等，這些方法單獨或聯合應用均取得了良好的效果［9-13］。但對于已發生壞疽的肢端和缺血肢體如何進行有效的局部處理，則長期被臨床醫生所忽視。壞疽肢端和缺血肢體的局部很容易繼發感染，一旦發生會影響下一步的治療，形成惡性循環，若處理不當很容易導致截肢。因此，對于壞疽肢端和缺血肢體的局部處理應成為肢體動脈缺血性疾病治療中的重要環節。朱長庚［14］、王軍等［15］應用中藥浸泡缺血的指(趾)端，發現可以明顯減少壞死范圍，為后續治療創造了有利條件。

筆者所在科室將丹參、丹皮、黃檗、苦參、黃連按一定比例用75%乙醇浸泡1周后制作成參黃液，用于浸泡肢體動脈缺血性疾病患者的壞疽肢端和缺血肢體，臨床隨訪觀察表明，該療法不但可以促進缺血肢體側支循環的建立，而且可以有效防止繼發感染，從而降低截肢平面，并且在一定程度上緩解缺血導致的肢體疼痛。因主要為外用，該藥在使用過程中幾乎無任何不良反應，但目前參黃液外用對缺血肢體的治療機制尚未見報道。

本研究通過建立大鼠后肢缺血模型，進一步證實了參黃液對缺血肢體的治療作用，而且初步揭示了其作用機制。對組織切片的分析表明，C組MVD顯著高于A、B組，提示參黃液可以有效促進缺血肢體組織中毛細血管的生成，從而建立側支循環。

VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，通過結合特異性受體導致血管內皮細胞增殖、遷移，延長其存活時間和增加血管通透性，從而調節血管的生長，促進新生血管和淋巴管的形成［16-18］。本研究結果顯示，參黃液可以有效促進大鼠缺血組織標本VEGF蛋白的表達，免疫組化分析顯示，應用參黃液的C組VEGF蛋白表達為強陽性，其積分光密度也顯著高于A、B組。從蛋白水平證實參黃液可以上調缺血肢體組織中VEGF蛋白的表達，從而促進患肢局部側支循環的建立以發揮治療作用，為揭示參黃液的作用機制提供了重要線索。

綜上所述，本研究進一步證實了參黃液對肢體缺血性疾病的治療作用，初步揭示了參黃液是通過調節VEGF蛋白的表達、促進側支循環建立而起到治療作用。不僅證實了參黃液是一種可以應用于臨床處理壞疽肢端和缺血肢體局部的有效藥物，而且為進一步闡明其作用機制提供了有力的實驗證據。

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