IL-1、IL-6在腰椎間突出盤中的表達(dá)及臨床研究

丁國(guó)良，李秀英，呂沐昕△，李秀英

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古包頭014030；2.內(nèi)蒙古包頭市第四醫(yī)院病案室 014030）

腰椎間盤突出癥是由于間盤變性，纖維環(huán)破裂，髓核突出刺激或壓迫神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)所表現(xiàn)出的以腰腿疼痛，間歇性跛行為主要癥狀的臨床綜合征。腰間盤退變是腰椎間盤突出癥的病理基礎(chǔ)，其中，髓核的退變最為明顯［1－2］。近10年來(lái)分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)對(duì)細(xì)胞因子和炎癥因子研究表明在退變的間盤組織中能產(chǎn)生炎性介質(zhì)，炎性介質(zhì)已被公認(rèn)為是導(dǎo)致間盤退變的主要因素之一，IL-1、IL-6被公認(rèn)為是與間盤退變相關(guān)的最重要的炎性細(xì)胞因子之一，可刺激炎癥細(xì)胞的聚集、激活和炎癥遞質(zhì)的釋放［3］。探討IL-1、IL-6在突出的間盤中的表達(dá)情況，以及他們與間盤突出程度之間的關(guān)系，對(duì)于揭示二者在間盤突出過(guò)程中所起的作用具有一定的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2013年9月在本院接受手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥患者30例（觀察組）。其中，男19例，女11例；年齡25～56歲，平均（41.32±7.24）歲。病程3～10年。椎間盤節(jié)段：L3～4 2例，L4～5 17例，L5～S1 11例。結(jié)合X線片表現(xiàn)與臨床所見(jiàn)，按間盤突出的程度分為3組：膨出型組8例，突出型組13例，游離型組9例。2012年3月至2013年9月在本院因外傷致腰椎骨折手術(shù)的患者20例（對(duì)照組），其中，男12例，女8例，年齡27～58歲，平均（42.35±6.49）歲。椎間盤節(jié)段：L1～2有6例，有L2～3有8例，L3～4有6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：傷前無(wú)腰椎間盤突出癥的典型臨床表現(xiàn)及椎管手術(shù)病史和相關(guān)的免疫系統(tǒng)疾病；術(shù)前檢查證實(shí)不存在與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的免疫系統(tǒng)疾病和急慢性感染病史；腰椎正側(cè)位X線片和CT掃描均未發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出，術(shù)中腰椎骨折處無(wú)間盤突出等肉眼所見(jiàn)的病理表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備為德國(guó)Hermle及芬蘭Labsystems公司，IL-l、IL-6ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Endogen公司，其余試劑均為進(jìn)口分裝。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)組患者全身麻醉后經(jīng)腰椎后路實(shí)行髓核摘除術(shù)，根據(jù)術(shù)中表現(xiàn)，對(duì)突出椎間盤按以下類型分別處理：（1）膨出型，取突入椎管與神經(jīng)根接觸部分；（2）突出型，取突破纖維環(huán)、后縱韌帶與神經(jīng)根接觸部分及肉眼分辨存在退變部分；（3）游離型，取游離到椎管內(nèi)部分及肉眼分辨明顯存在退變部分。術(shù)中切取病變椎間盤的髓核組織為標(biāo)本。對(duì)照組患者全身麻醉后經(jīng)前路或后路手術(shù)，腰椎骨折患者于骨折椎體間盤部位吸取少許椎間盤的髓核組織為標(biāo)本。

1.2.1 檢測(cè)方法 每位患者標(biāo)本均分成兩份，第一份制成石蠟切片行HE染色、免疫組化法；第二份進(jìn)行ELISA檢測(cè)。術(shù)中取出的第一份髓核組織用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1mol／L，pH＝7）反復(fù)沖洗凈沾染的血液等，編號(hào)后置于－20℃冰箱保存。待標(biāo)本統(tǒng)一收集后風(fēng)干，稱質(zhì)量，超聲粉碎后每100mg組織加1.00mL PBS，冰浴下以玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿，以5 000r／min的速率離心30min，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。第二份標(biāo)本采用ELISA法檢測(cè)，檢測(cè)方法如下：（1）包被，用包被液稀釋包被用HBsAg至所需要量，每孔加0.10mL，置于4℃24h，用蒸餾水洗1次，每次均需要注滿各孔；（2）封閉，用封閉液封閉，每孔加0.20mL；（3）加樣，每塊板均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照50.00mL，加入酶標(biāo)抗體，混勻后，蓋封板紙；（4）孵育，置于37℃30min；（5）洗滌，用洗滌液洗5次；（6）顯色，每孔加底物0.1mL，37℃，10min；（7）終止，每孔加2mol／L硫酸0.05mL終止反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，臨床資料符合正態(tài)分布，則采用配對(duì)檢驗(yàn)；若臨床資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 鏡下可見(jiàn)IL-1及IL-6表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞在突出腰椎間盤周圍的炎性肉芽組織中表達(dá)最強(qiáng)，見(jiàn)圖1、2。

圖1 IL-1的表達(dá)情況

圖2 IL-6的表達(dá)情況

觀察組中，30例患者共有19例腰間盤組織中IL-1陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為63.33%。其中，膨出型組中陽(yáng)性表達(dá)3例，突出組中陽(yáng)性表達(dá)8例，游離組中陽(yáng)性表達(dá)8例。對(duì)照組中20例患者1例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為5.00%。觀察組與對(duì)照組IL－1陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15.41，P＜0.01）。游離組與膨出組IL-1陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 IL-1在不同類型腰椎間盤組織中的表達(dá)

觀察組中，30例突出腰椎間盤組織中IL-6表達(dá)陽(yáng)性有16例，陽(yáng)性率53.33%。其中，膨出型陽(yáng)性表達(dá)2例，突出型陽(yáng)性表達(dá)7例，游離型7例。對(duì)照組中20例患者無(wú)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。觀察組與對(duì)照組IL-6陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15.68，P＜0.01）。游離型與膨出型IL-6陽(yáng)性率比較，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 IL-6在不同類型腰椎間盤組織中的表達(dá)

2.2 ELISA法檢測(cè)結(jié)果 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。對(duì)不同類型髓核中IL-1水平進(jìn)行比較，突出型與膨出型比較，t＝11.10，P＜0.01；游離型與膨出型比較，t＝12.84，P＜0.01；游離型與突出型比較，t＝4.44，P＜0.01，對(duì)不同類型髓核中IL-6水平進(jìn)行比較，突出型與膨出型比較，t＝4.57，P＜0.01；游離型與膨出型比較，t＝11.96，P＜0.01；游離型與突出型比較，t＝9.26，P＜0.01，見(jiàn)表2。

表1 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較（±s，pg／mL）

表1 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較（±s，pg／mL）

組別 n IL-1 IL-6觀察組30 13.93±1.09 32.26±9.63對(duì)照組20 3.12±0.23 5.30±1.87

表2 不同突出類型髓核中IL-1水平比較（±s，pg／mL）

表2 不同突出類型髓核中IL-1水平比較（±s，pg／mL）

＊：P＜0.01，與膨出型比較；△：P＜0.01，與突出型比較。

類型 n IL-1 IL-6膨出型8 9.27±0.68 11.36±3.25突出型 13 14.31±1.16＊ 24.42±7.61＊游離型 9 16.86±1.54＊△ 62.16±11.58＊△

3 討 論

3.1 間盤突出致痛的機(jī)制 目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，椎間盤源性下腰痛產(chǎn)生的機(jī)制有3種：（1）機(jī)械壓迫。突出的椎間盤對(duì)神經(jīng)根產(chǎn)生壓迫，使其靜脈回流受阻，毛細(xì)血管血流減少，影響神經(jīng)根的營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)一步增加水腫，從而增加了神經(jīng)根對(duì)疼痛的敏感性。（2）炎性反應(yīng)。在手術(shù)中常可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)根炎性充血水腫。原因在于破裂的椎間盤會(huì)釋放出許多化學(xué)刺激性物質(zhì)，導(dǎo)致受累的神經(jīng)根或脊神經(jīng)節(jié)發(fā)生炎性反應(yīng)。此時(shí)神經(jīng)根對(duì)疼痛敏感度增加，即使沒(méi)有突出髓核的直接壓迫，也會(huì)出現(xiàn)腰腿痛的癥狀。（3）神經(jīng)體液。椎間盤纖維環(huán)、后縱韌帶、關(guān)節(jié)囊部位富含神經(jīng)肽。損傷時(shí)神經(jīng)肽類物質(zhì)釋放，可直接刺激周圍的感受器引發(fā)疼痛［4］。

3.2 炎性因子 炎癥因子是由細(xì)胞、體液產(chǎn)生的參與炎性反應(yīng)的一類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子在椎間盤退變（IVDD）中可能發(fā)揮著重要的作用，主要包括椎間盤基質(zhì)的合成與分解、炎性反應(yīng)和椎間盤細(xì)胞凋亡等方面的作用［5］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)IL、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和集落刺激因子（CSF）等炎性細(xì)胞因子。其中，IL家族是一類重要的炎性因子，而IL-1、IL-6被公認(rèn)為是與椎間盤退行性變相關(guān)的最重要炎性因子［6－7］。

3.2.1 IL-1 IL-1在椎間盤退變過(guò)程中的作用是多環(huán)節(jié)的，IL-1因子的主要作用是控制促炎性反應(yīng)對(duì)組織的損傷，可通過(guò)病原體相關(guān)分子模式或者危害相關(guān)分子模式使受損害的細(xì)胞釋放出來(lái)。國(guó)外學(xué)者研究表明，IL-1在軟骨基質(zhì)中的新陳代謝中起重要作用，IL-1可抑制金屬蛋白酶組織抑制劑的合成，并通過(guò)干擾椎間盤基質(zhì)的合成而加重椎間盤的退行性變［8］。IL-1還可以刺激單核細(xì)胞分泌堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），后者是內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的有絲分裂原，從而間接影響突出間盤組織新生血管的形成和纖維化過(guò)程［9］。IL-1本身可能是一種強(qiáng)有力的致痛物質(zhì)。IL-1β致痛效率是IL-1α的3 000倍［10］。有研究表明，IL-1可促進(jìn)磷脂 A2（PLA2）的激活，而PLA2是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可促進(jìn)前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介質(zhì)的分泌，且PLA2通過(guò)酶解細(xì)胞膜磷脂可直接造成細(xì)胞膜損害［11］。

3.2.2 IL-6 IL-6作為重要的炎性介質(zhì)，在類風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)病及骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用，它已被認(rèn)為是引起關(guān)節(jié)破壞和炎癥發(fā)生的重要介質(zhì)。IL-6可能通過(guò)影響椎間盤基質(zhì)降解酶的抑制酶而發(fā)揮作用。基質(zhì)降解酶能改變椎間盤基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖、膠原和彈性蛋白等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、水平及類型，削弱了纖維環(huán)的保護(hù)作用，使髓核易從薄弱的纖維環(huán)處突出［12］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，觀察組中30例髓核標(biāo)本IL-1和IL-6陽(yáng)性率分別為63.33%和53.33%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。ELISA法檢測(cè)觀察組IL-1和IL-6水平分別為（13.93±1.09）pg／mL、（32.26±9.63）pg／mL，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且不同類型髓核中IL-1和IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明突出型髓核組織中的IL-1、IL-6水平明顯升高，且IL-1、IL-6水平隨著間盤退變程度的加重逐漸升高，即表現(xiàn)為游離型大于突出型大于膨出型。

本研究成果在臨床工作中有多方面的指導(dǎo)意義，今后在治療腰椎間盤突出的患者時(shí)，不要片面地認(rèn)為腰腿痛癥狀只來(lái)源于機(jī)械壓迫，炎性因子的刺激同樣很重要，可以在制訂治療方案時(shí)充分考慮到這一點(diǎn)，是否手術(shù)應(yīng)綜合考慮，手術(shù)后用藥治療因想到使用抑制炎性因子分泌的藥物，長(zhǎng)期隨訪的患者是否可以檢測(cè)血清IL-1、IL-6水平。筆者在健康體檢方面是否可以細(xì)化到細(xì)胞水平，是否可以早期篩查一些腰椎間盤突出的高危人群，以期達(dá)到預(yù)防為主，治療為輔的目的，這些都是值得考慮的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)使筆者加深了對(duì)椎間盤疾病病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，對(duì)提前干預(yù)椎間盤退變，緩解椎間盤疾病引起的神經(jīng)根痛方面有著積極的意義。

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