uPA-siRNA重組慢病毒載體感染兔軟骨細胞對uPA和MMP-3表達的影響＊

史晨輝，王維山，李長俊，張振東，郭風勁，陳安民△

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科，武漢430030；2.石河子大學醫學院附屬醫院骨科，新疆石河子832008）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退行性改變和軟骨下骨代謝異常為主要病理特征，伴隨有關節周圍骨贅形成、關節周圍軟組織攣縮、關節滑膜炎性反應的關節疾患，其以關節疼痛、功能障礙為主要臨床表現［1］。目前研究表明，OA病變與老齡、性別、肥胖、創傷、遺傳等多因素有關，但是軟骨組織的降解大于合成造成軟骨漸進性退變是其最基本的病理改變［2］。在軟骨降解過程中，尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator receptors，uPA）和基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase，MMP-3）發揮著極其重要的作用［3－4］。有研究表明，uPA可激活軟骨組織及滑膜組織分泌的無活性的前體 MMP-3（Pro-MMP-3），然后同活性 MMP-3共同作用于軟骨組織中膠原蛋白的裂解，因此，抑制軟骨組織及滑膜組織表達uPA可能是OA防治的一個途徑［5］。目前，較為成熟的RNA干擾（RNAi）技術可抑制靶基因的表達而達基因沉默效應。但通過RNAi技術抑制uPA間接降低MMP-3表達的研究尚未見文獻報道。本課題組在篩選uPA-siRNA靶向序列的基礎上，通過慢病毒包裝并加載GFP，觀察其感染軟骨細胞后對細胞表達uPA、MMP-3基因和蛋白的影響，以期為進一步研究uPA在OA病變中的防治作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2月齡新西蘭兔購自新疆醫科大學實驗動物中心，uPA-siRNA序列由本實驗室保存。Lentivirus-NC病毒液和pGLV-H1-GFP＋Puro載體購自上海吉瑪公司。BamHI、EcoRI內切酶購自 MBI Fermentas公司，Lipofectamine 2000轉染試劑、Trizol試劑、DMEM／F12培養基均購自Invitrogen公司。Taq酶、質粒抽提試劑盒購自Takara公司，uPA和MMP-3抗體均購自Abcam公司。引物合成：采用Oligo6.0軟件設計uPA、MMP-3及內參基因β-actin檢測引物，由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 方法 取原代生長良好的兔膝關節軟骨細胞以每孔1.2×104個細胞傳代接種于24孔培養板中進行常規培養，當軟骨細胞匯合至50%以上時，按照感染復數（MOI）值為1、10和100的病毒細胞比加入慢病毒顆粒液，共同培養96h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，確定最佳MOI值。并用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0分析病毒轉染效率。

根據實驗以最佳MOI值的uPA-siRNA轉染組設立為實驗組（轉染uPA-siRNA慢病毒載體），同時設立不加病毒的空白對照組（未進行任何處理）、空載體組（轉染慢病毒載體）和藥物干預組［加載MMP特異性抑制劑（TIMP）］。實驗組：uPA-siRNA序列經慢病毒包裝并加載GFP，通過Lipofectamine 2000轉染入兔軟骨細胞；空載體組：將慢病毒載體通過Lipofectamine 2000轉染入兔軟骨細胞；空白對照組正常培養軟骨細胞；藥物對照組：給予特異性MMP抑制劑。所有細胞培養96h后應用實時定量－聚合酶鏈反應（RT-PCR）和 Western blot法分別檢測軟骨細胞uPA mRNA、MMP-3mRNA和蛋白的表達水平。PCR產物經20g／L瓊脂糖凝膠電泳分離，應用Bio-Rad凝膠成像系統照相，以及Quantity One軟件分析圖像，mRNA的相對表達量以擴增產物條帶的光密度值與β-actin條帶吸光度值之比值表示。Western blot經X線片在凝膠成像系統掃描，采用Quantity one軟件分析圖像，以GAPDH作為內參。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 慢病毒轉染效率的檢測 利用倒置熒光顯微鏡觀察4個序列慢病毒載體在不同MOI時對293T細胞和軟骨細胞的轉染效率。隨著MOI的增加，慢病毒的轉染效率也隨之增加，當MOI為100時，轉染效率可達85%以上，符合后續實驗要求，見圖1。

2.2 軟骨細胞uPA mRNA和 MMP-3mRNA檢測 應用相對RT-PCR以β-actin作為內參照，實驗結果采用標準曲線分析法進行數據分析。結果顯示，實驗組uPA mRNA和MMP－3 mRNA表達水平顯著降低，而空載體組、空白對照組和TIMP組uPA mRNA、MMP-3mRNA表達量較高（P＜0.01）。空載體組與空白對照組間uPA mRNA、MMP-3mRNA表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 慢病毒在不同MOI值下轉染293T細胞、軟骨細胞72h后的熒光圖（免疫熒光法，×200）

2.3 軟骨細胞uPA和 MMP-3蛋白檢測 實驗組uPA和 MMP-3蛋白表達水平顯著降低，而空載體組和空白對照組uPA、MMP-3蛋白表達量較高（P＜0.01），實驗組與 TIMP組之間uPA蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01），而 MMP-3蛋白表達無明顯差異統計學意義（P＞0.05），表明抑制uPA表達可降低MMP-3蛋白表達水平，而TIMP對uPA表達無影響，見圖3、4。

圖2 uPA PCR擴增曲線及轉染后軟骨細胞uPA、MMP-3基因表達水平

圖3 uPA蛋白表達水平

圖4 MMP-3蛋白表達水平

3 討 論

隨著社會老齡化的加重及人口平均壽命的延長，OA已經成為嚴重影響中老年生活質量的疾病之一。研究表明，OA以關節軟骨組織的退行性改變伴隨有關節周圍新生骨的形成為病理特點，以關節疼痛、功能障礙為臨床表現，在OA病變過程中，軟骨下骨也出現骨硬化、骨質疏松等代謝異常表現，其復雜的病理表現給OA的病因學研究帶來了一定的困難。目前，人們普遍認為OA病理變化涉及軟骨組織、軟骨下骨及滑膜在內的所有關節結構部分，是組織創傷、代謝、基因、遺傳和免疫等多因素作用的結果［2］。但是其最根本的病理變化是關節軟骨組織的降解大于合成，軟骨組織漸進性退化后出現關節疼痛、關節狹窄、關節畸形及功能障礙。在軟骨組織的降解過程中，MMPs由于其能廣泛的降解膠原而發揮著主要的作用。MMPs家族中對膠原裂解起重要的作用的酶是 MMP-3和MMP-13，但是在軟骨組織收到內源性或外源性刺激后，軟骨細胞和滑膜細胞首先分泌的是沒有活性的Pro-MMPs，Pro-MMPs系統在uPA激活Pro-MMP-3為活性的 MMP-3后出現瀑布樣階聯放大效應，大量MMPs被激活從而參與軟骨組織的降解過程［6－7］；而在關節組織中存在天然TIMP，其可抑制家族的裂解膠原功能，通常二者保持平衡狀態，共同調節細胞外基質的降解與合成代謝。但是當內源性和外源性刺激物持續存在的情況下，MMPs的分泌多于TIMP從而出現細胞外基質的降解過程。已有的文獻證實［1，8－10］，軟骨細胞和滑膜細胞分泌的uPA在OA早期病變中起著至關重要的作用，其不但可以促進滑膜組織大量分泌IL-1β和TNF－α，后者參與滑膜炎性反應加重軟骨降解代謝過程；也可以直接作用于軟骨細胞外基質的降解；尤為重要的是uPA可以激活 MMP-3酶原，使其活化為活性增強20倍的蛋白降解酶，促進軟骨組織膠原的降解，而 MMP-3作為最好的催化劑，激活 Pro-MMP-1，2，13等共同參與軟骨組織的降解過程。因此，通過抑制滑膜組織和軟骨組織中uPA的表達，可改善軟骨組織中的降解性代謝過程，從而達到緩解或者改善OA早期軟骨組織的病理變化。

RNAi技術是近年來發展起來的高效基因沉默技術，當內外源性雙鏈RNA進入細胞后可引起與其同源的mRNA特異性降解，進而抑制相應基因表達，是一種簡單高效的代替基因敲除的新興生物技術。目前，已經在基因功能的研究及部分基因治療方面發揮了重要的作用［11－12］，研究證實RNAi基因沉默效果顯著，應用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產物的含量降低90%以上，一定條件下甚至可達到基因完全敲除的效果。但目前研究的難度是RNAi表達載體在目的細胞中的轉染，現有的化學方法、電轉染、腺病毒載體法等均有轉染效率低，轉染穩定性差等問題。而慢病毒載體能夠成功克服上述問題，可高效轉染宿主細胞，尤其是對原代細胞和懸浮細胞等不易感染的細胞亦有較高的轉染效率，且轉染穩定，目的基因長時間沉默，能持久的發揮RNA干擾效應［13－14］。筆者構建的靶向uPA-siRNA慢病毒表達載體，轉染軟骨細胞的效率高達85%，為進行OA病理機制與治療等相關研究的奠定了重要基礎。

Sato等［10］研究證實，通過抑制組織中uPA的水平，可間接降低MMP-3的表達，從而減緩細胞外基質的降解過程。Korshunov等［15］研究也表明，uPA可快速高效激活Pro-MMP-3為活性的 MMP-3，MMP-3又可快速激活 Pro-MMP-9，大量MMP-3，9又可刺激細胞分泌更多的uPA，從而在細胞外基質降解病理過程中形成一個惡性循環，通過早期干預，抑制uPA的表達水平，可顯著減緩組織膠原的降解。筆者前期構建了靶向uPA-shRNA序列并進行慢病毒包裝，本研究在進行慢病毒包裝時加載了GFP，轉染軟骨細胞后觀察不同分組之間uPA、MMP-3基因和蛋白的表達水平，結果顯示uPA-siRNA慢病毒載體可高效轉染軟骨細胞，其可顯著抑制uPA、MMP-3基因和蛋白的表達水平，而同期應用 MMP-3抑制劑TIMP后，其只抑制了 MMP-3蛋白的表達，對uPA、MMP-3基因和uPA蛋白的表達未產生任何影響，進一步表明沉默uPA在OA病變早期基因治療中的價值，也間接證明uPA作為調控MMP-3表達的上游因子，在MMP-3相關分子信號通路中發揮著極其重要的作用。筆者后續將通過動物實驗進一步驗證此項研究結果，為進一步研究uPA基因在OA病變中的作用機制及其治療作用奠定實驗基礎。

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