加味四物湯對血小板減少性紫癜小鼠影響的實驗研究＊

馮曉燕，顧 鴻，楊長福，施建南，嚴魯萍

（貴陽中醫學院，貴州貴陽520002）

特發性血小板減少性紫癜（ITP）是一組因外周血中血小板減少而導致皮膚、黏膜或內臟出血的疾病，發病率很高，臨床約占出血疾病總數的30%。加味四物湯是貴州省省級名老中醫嚴魯萍教授和貴陽中醫學院第二附屬醫院血液內科生醫在四物湯的基礎上總結多年的臨床經驗，不斷探索而成，該方劑用于治療ITP療效顯著。為研究加味四物湯對ITP的藥效及作用機制，本科用免疫法建立ITP動物模型，對此方進行動物實驗研究，探討該藥的臨床作用及其與免疫因素的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 KM小鼠74只，體質量18～22g雌雄各半，SPF級，由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部提供，合格證號：SCXK（湘）2009-0012。戊巴比妥鈉，Sigma公司產品（貨號：P3761）。醋酸潑尼松，市售，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，國藥準字H133021207，生產批號：1205150。加味四物湯（當歸15g、白芍15g、熟地12g、川芎15g、太子參10 g、紫珠草24g、土大黃24g、枸杞10g、黃芪25g、茜草根12g、側柏葉10g），由貴陽中醫學院第二附屬醫院藥劑科提供。將上述藥物按人和動物比例折算用量，用蒸餾水浸泡30min，煎煮2次（30分鐘／次）后，過濾、合并濾液并加熱蒸發，制成100%水煎濃液（含生藥量為1g／mL），于4℃冰箱中保存備用，使用時常溫靜置40min、充分搖勻。

1.2 儀器與試劑 Muctiskan Go酶標儀為Thermo公司生產。Sysmex XT-2000i全自動血細胞計數儀，日本生產；IL-6試劑盒由R＆D公司提供，生產編號：10-27-907。80-2離心沉淀器由上海手術器廠生產，弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）為Sigma公司產品。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）的制備 取KM小鼠，5%戊巴比妥鈉麻醉，眼球取全血，乙二胺四乙酸－二鈉（EDTA-Na2）抗凝，離心分離血小板，調整血小板數至1×109／mL；取分離的血小板分別與等量FCA和FICA混合成油包水狀做抗原，取含FCA抗原1mL于0周注射豚鼠足掌、背及腹部皮下至少6位點，取含FICA抗原1mL分別于1、2、4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少6點，第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，離心分離血清即為GP-APS，分裝貯存于－20℃冰箱。將GP-APS從－20℃冰箱取出，56℃水浴30 min，用等量KM小鼠紅細胞吸附2次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度待用。

1.3.2 造模與分組 KM小鼠74只，隨機分成健康組14只、模型生理鹽水組20只、西藥組20只和中藥組20只，每組雌雄各半。除健康組外，各組參照參考文獻［1-3］造模方法并加以改進，隔日1次按每20g／100μL腹腔注射1∶4稀釋的GPAPS，造模第8天開始各組均按每20g 0.2mL劑量灌胃，連續10d；其中，模型生理鹽水組按每20g 0.2mL劑量灌胃給生理鹽水，西藥組以潑尼松按成人60mg／d劑量換算后，按每10g 0.01mg劑量灌胃，中藥組按每20g 0.2mL劑量灌胃。

1.4 指標及檢測方法 實驗中觀察小鼠的活動量，飲食飲水量，皮毛光澤度、皮膚淤血出血、體質量改變及死亡數量等基本情況。實驗結束后通過股動脈取血，EDTA-Na2抗凝，采用全自動血細胞記數分析儀檢測外周血，離心分離血清，采用雙抗夾心ELISA法，按試劑盒說明方法測定血清IL-6水平。按文獻［4］方法快速剝離股骨，用6號針頭以1mL生理鹽水沖出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管內，制成骨髓細胞懸液，采用全自動血細胞記數分析儀檢測骨髓有核細胞數量。實驗結束后處死小鼠，剖胸腹，取胸脾，置于電子天平上稱質量；胸腺指數＝胸腺質量／體質量，脾臟指數＝脾臟質量／體質量。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行數據處理，實驗結果以±s表示。對于滿足正態性、方差齊性的多組數據之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實驗動物一般情況 整個實驗期間，正常組小鼠活動量大，行動敏捷，反應靈敏，毛色光澤，體質量均增加，實驗結束時小鼠的體質量平均增加6g左右。模型組小鼠第1次注射GPAPS 1d后，開始逐漸出現瞇眼、毛散亂豎起、活動量減少，鼻部顏色變白，飲食飲水量減少，體質量減輕等現象，造模后第8天模型組小鼠逐漸出現了較明顯的皮下紫癜，實驗結束時模型組小鼠體質量平均減輕7g左右。除健康組沒有小鼠死亡外，西藥組死亡6只，其中雌鼠4只，雄鼠2只；生理鹽水組小鼠死亡8只，其中雌鼠6只，雄鼠2只；中藥組小鼠死亡5只，雌鼠3只，雄鼠2只。

2.2 各組小鼠外周血象的變化 與正常組比較，模型組小鼠除RBC外 WBC、PLT均顯著降低（P＜0.01）。西藥組與中藥組外周血WBC與PLT計數均明顯上升（P＜0.05），但中藥組上升更顯著（P＜0.05）。西藥組與中藥組比較，外周血 WBC、RBC、PLT組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組小鼠骨髓有核細胞數的變化 與正常組比較，各實驗組小鼠骨髓有核細胞數量顯著降低（P＜0.01）。與模型生理鹽水組比較，西藥組與中藥組骨髓有核細胞數量均增加，其中，西藥組P＜0.05，中藥組P＜0.05，見表2。

表1 各組小鼠外周血象

2.4 各組小鼠血清IL-6水平的變化 各模型組小鼠血清IL-6水平與健康組比較，均明顯下降（P＜0.05），其中，模型生理鹽水組下降最多（P＜0.01）。與生理鹽水組比較，西藥組、中藥組血清IL-6水平均顯著上升（P＞0.05），見表3。

2.5 各組小鼠胸脾指數變化 各模型組胸腺指數、脾臟指數與健康組比較均顯著下降（P＜0.05），其中，模型生理鹽水組下降最顯著（P＜0.01）。與模型生理鹽水組比較，西藥組，中藥組脾臟指數與胸腺指數均有顯著上升（P＜0.05），見表4。

表2 各組小鼠骨髓有核細胞數

表3 各組小鼠血清IL-6水平

表4 各組小鼠脾臟、胸腺指數（±s）

表4 各組小鼠脾臟、胸腺指數（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與健康組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與模型生理鹽水組比較。

組別 n 脾臟指數 胸腺指數健康組14 0.003 92±0.000 67 0.004 24±0.001 40模型生理鹽水組 12 0.001 29±0.00047b 0.002 63±0.001 57b西藥組 14 0.002 18±0.000 86da 0.003 81±0.001 42ac中藥組 15 0.001 81±0.000 41db 0.003 99±0.001 49ac

3 討 論

ITP屬于中醫“血證”、“發斑”、“肌衄”、“發斑”、“陰陽毒”“葡萄疫”等范疇，部分嚴重病例并發腦出血者可歸屬“中風”范疇。現代醫學家將ITP命名為“紫癜病”［5］。目前，臨床上西醫主要應用止血藥、糖皮質激素、免疫抑制劑、雄性激素、脾切除術和血漿置換、單抗和促細胞生成因子等進行治療［6］，取得了一定的療效。但西藥治療存在不良反應大、停藥或減量易復發、易反彈等問題。近些年來，中醫中藥在本病的治療上取得可喜的成績，有了很大的進展［7－8］，在一定程度上彌補了西醫治療的不足，中藥不良反應小，改善癥狀明顯、費用相對低廉、治病根本等。四物湯是祖國醫學中經典的補血名方，該方用血中之血藥熟地、白芍配伍血中之氣藥當歸、川芎，動靜結合，剛柔相濟，使血虛能補、血瘀能行、血燥能潤、血溢能止，達到補血不滯血、和血不傷血的目的［9］。加味四物湯是在四物湯原方基礎上，佐以益氣健脾、養陰清熱的中藥而成。有研究表明，該藥方能提升PLT水平、改善粒系病態造血，對再生障礙性貧血、ITP有較好療效［10－11］。研究表明，黃芪及其合劑對PLT的恢復有促進作用［12］，促進骨髓粒系造血，使骨髓體外培養粒細胞、巨噬細胞（CFU-GM）集落數明顯增加［13］。

ITP的病因和發病機制到目前仍不很明確，除了認為細菌或病毒感染與其發病有密切關系，與肝脾的作用有關外，不少的研究表明是體液免疫、細胞免疫及巨核細胞等的調控異常和人類細胞抗原遺傳多態性等多方面綜合作用的結果［14－15］。IL-6是一種由免疫活性細胞分泌的多功能因子，具有免疫調節及抗腫瘤作用，同時也有顯著的造血調控作用。它的生物活性主要有促進B細胞增生分化和分泌抗體，活化T細胞和NK細胞、刺激肝細胞分泌急性肝細胞蛋白，促進造血干細胞增殖，使垂體分泌促腎上腺皮質激素，使形狀細胞分泌神經生長因子樣活性物質等。有研究表明細胞因子IL-6，sIL-2R參與了ITP的發病過程［16］。

本實驗研究結果顯示中藥方劑加味四物湯具有與潑尼松一樣能增加ITP模型小鼠外周血 WBC、PLT水平，促進骨髓有核細胞增殖，使血清IL-6的水平明顯上升的作用。

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