益母草注射液有效部位提取及其對凝血系統的影響研究?

趙小梅，彭 成 ,熊 亮，謝曉芳

(成都中醫藥大學藥學院，成都 610075)

近年來，文獻頻頻報道益母草注射液在臨床上預防產后出血療效顯著，但益母草屬于傳統中藥學的活血化瘀類藥?，F代藥理研究亦表明，其具有活血的作用，包括抗血小板聚集、抗凝、纖溶等活性[1～4]。益母草注射液作為具有代表性意義的成藥，用于產后出血主要取其具有收縮子宮的功效，但對其活血化瘀有效物質基礎以及活血而不加重產后出血的作用機制尚無深入研究。因此，作者通過提取分離益母草注射液有效部位，深入探索其對凝血系統的影響及其作用機制，為益母草注射液二次開發或指導臨床安全用藥提供科學的參考依據。

1 材料

1.1 動物

10只健康雌性SD大鼠，體質量200±20 g，由成都中醫藥大學動物實驗中心提供(質量合格證號SCXK(川)2008-11)。6只健康雄性SD大鼠，體質量200±20 g，由成都中醫藥大學動物實驗中心提供(質量合格證號SCXK(川)2008-11)。

1.2 藥物

阿司匹林腸溶片由辰欣藥業股份有限公司生產(批號120529210)。

1.3 試劑

凝血酶原時間(PT，批號545487)、活化部分凝血活酶時間(APTT，批號547163A)、纖維蛋白原(FIB，批號538043)及凝血酶時間(TT，批號42282)測定試劑均購自德國SIEMENS公司。腺苷二磷酸(ADP，批號SLBB1854)、纖維蛋白原(Fibrinogen,批號F8630)、凝血酶(Thrombin, 批號T4648)均由美國Sigma公司生產。瓊脂粉(Agar，JAPAN進口分裝，分裝號89054120，購自溶海生物技術(成都)有限公司)，PBS磷酸鹽緩沖液粉末(批號20130311，北京中杉金橋生物科技有限公司)。

1.4 儀器

日本SYSMEX株式會社CA-500型血凝儀，SC-2000血小板聚集測試儀，德國Heraeus臺式離心機Biofuge Stratos，Sanyo CO2培養箱MLO-15A。

2 方法

2.1 益母草注射液有效部位的制備

益母草注射液浸膏(1200 g)經水分散溶解，上樣于D101型大孔吸附樹脂，以水-乙醇梯度洗脫，回收溶劑得水及15%、30%、45%、60%、95%乙醇洗脫部分。水洗脫部分(550 g)上樣于732型強酸型離子交換樹脂，以水及3 mol/L的NaCl溶液洗脫。水洗脫部分回收溶劑得非生物堿部分(300 g)。NaCl溶液洗脫液用NaOH調pH至6-7，回收溶劑，所得固形物加甲醇超聲提取過濾，殘渣重復處理3次，合并濾液并回收溶劑得生物堿部分(220 g)。上述非生物堿部分、生物堿部分采用去離子水稀釋備用。

2.2 樣本采集與測定方法

2.2.1 體外凝血4項值的測定 取雌性SD大鼠10只，采用20%烏拉坦麻醉，經股靜脈取血，每只3.6 ml，以3.8%枸櫞酸三鈉1∶9抗凝，經3500 r離心10 min，可獲得2 mL左右血漿。取200 μL×7份，可平行進行7組實驗：陰性對照組、益母草注射液水溶性非生物堿部分高、中、低劑量組和益母草注射液水溶性生物堿部分高、中、低劑量組，于實驗前分別加入20 μL相應藥物，其中陰性對照組加入生理鹽水，實驗組分別加入不同劑量的實驗藥物。經充分混勻，37 ℃溫浴5 min。以全自動血凝儀測定各組凝血4項指標值，每組重復10次。

2.2.2 體外血小板聚集率的測定 取雄性SD大鼠6只，采用20%烏拉坦麻醉，經股靜脈采血每只取血3.6 mL，3.8%枸櫞酸三鈉1∶9抗凝，25 ℃離心200 g×10 min，取上液作為PRP，剩余部分繼續離心2200 g×10 min作為PPP，采用同只鼠的PPP稀釋PRP至2.5～3.5×108/mL，每只鼠的PRP可平均分成300 μL×8份，平行進行8組實驗，即陰性對照組、陽性對照組、益母草注射液水溶性非生物堿部分高、中、低劑量組和益母草注射液水溶性生物堿部分高、中、低劑量組。應用SC-2000四通道血小板聚集儀，按Born比濁法[5]測定血小板聚集性。用PPP調零，取300 μl PRP分別加入20 μL相應藥物，37 ℃溫浴5 min，然后加入5 μmol ADP，每次測試時間為5 min，記錄最大聚集率，計算血小板聚集抑制率=(對照管血小板最大聚集率-給藥管血小板最大聚集率)/對照管血小板最大聚集率×100%，每組重復6次。

2.2.3 體外纖維平板實驗 參照文獻方法[6]，用PBS緩沖液配制10 mg/mL纖維蛋白原溶液、1 U/mL凝血酶和100 U/mL尿激酶。取0.2 g瓊脂粉加20 mLPBS緩沖液加熱溶解，待溫度降至55～60 ℃時，取18 mL放入玻璃杯中，加入30 ℃的纖維蛋白原溶液1 mL，搖勻后再加入30 ℃的凝血酶溶液1 mL，搖勻后立即放入水平放置的90 mm玻璃培養皿中，待冷凝后采用7 mm中空打孔器打孔。在孔中加入相應藥物50 μl，其中陰性對照組加入生理鹽水，陽性對照組加入尿激酶，實驗組分別加入不同劑量的益母草注射液水溶性非生物堿和益母草注射液水溶性生物堿。然后將平板放入37 ℃的培養箱，16 h后測定結果，每組重復6次。

3 結果

3.1 益母草注射液兩大部分體外給藥對凝血4項指標的影響(表1)

表1 益母草注射液有效部位體外給藥對凝血四項的影響

注：n代表樣本量，與陰性對照組比較：△P<0.05，*P<0.01

益母草注射液水溶性非生物堿部分能明顯延長PT和APTT，其水溶性生物堿部分能明顯縮短APTT，兩者均能明顯降低血纖維蛋白原含量和延長TT。

3.2 體外血小板聚集實驗的測定結果

表2顯示，益母草注射液兩大部分均具有明顯的抗ADP誘導血小板聚集作用，尤以益母草注射液水溶性非生物堿部分的抗血小板聚集作用更強。

3.3 體外纖維平板實驗測定結果

表3顯示，益母草注射液水溶性非生物堿部分具有明顯的纖溶活性，且呈明顯的量效關系，益母草注射液水溶性生物堿部分未見明顯的纖溶活性。

表2 益母草注射液有效部位體外給藥對ADP誘導血小板聚集的影響

注：與陰性對照組比較：△P<0.05，*P<0.01(n代表樣本量)

表3 益母草注射液有效部位體外給藥對纖維蛋白的溶解作用

注：n代表樣本量

4 討論

近年來，隨著人們對妊娠機體生理變化認識的逐漸深入，研究發現在妊娠過程中孕婦表現為凝血功能逐漸增強、纖溶功能逐漸減弱的生理變化，血液呈現高凝狀態，這樣一種生理變化能為產后快速有效地止血提供物質基礎，但部分婦女可能出現病理狀態。病理性高凝狀態極易誘發DIC和血栓性疾病[7，8]，如妊娠期易栓癥及分娩后發生血栓的風險極度升高。因此，對于易栓癥患者在治療原發癥的同時，抗凝治療起著不可替代的作用[9，10]。但目前臨床上最常用的肝素易誘發嚴重出血，而對于易栓癥患者抗凝治療應以產時不引起過度失血為目的[11]，因此迫切需要找到新型抗凝藥物。

本研究中發現，益母草注射液同時具有活血與止血作用，止血作用機制與縮短內源性凝血時間有關，活血作用機制與延長內外源性凝血時間、抗血小板聚集和纖溶有關。目前的臨床報道表明，益母草注射液產后給藥并不增加產后出血量[12]，這種天然的配伍形式比較適合臨床預防產婦血栓性疾病和DIC發生。如能更好地協調兩大部分的配比，可為產科抗凝治療開辟新的局面。該提取分離方法對益母草注射液二次開發具有重要意義。

此外，本研究結果中，益母草注射液水溶性非生物堿部分和生物堿部分都能明顯降低血纖維蛋白原含量，但在纖維平板實驗中后者卻未見明顯的纖溶活性，表明前者對已形成的纖維蛋白仍存在降解作用，而后者卻僅對纖維蛋白未形成前有作用，具體機制有待進一步研究。

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