類風濕關節炎與表觀遺傳學?

巨少華， 代 淵， 王 平， 徐世軍△

(1.四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137；2.成都中醫藥大學，成都 611137)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節滑膜炎為主的全身性自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性侵蝕性炎癥和自身免疫進程為特征，常常累及周圍關節[1]。其病理表現主要為由免疫反應引起的滑膜炎、增生和肉芽浸潤，從而破壞關節的軟骨面、軟骨下骨質、關節囊、韌帶和肌腱組織，逐漸導致關節的強直、畸形和功能嚴重受損，表現為慢性對稱性的關節炎[2]。我國RA患病率為0.32～0.36%左右[3]，世界上約有1%的人受其影響[4]。近年來對于RA發病機制的認知和治療策略有了顯著的改善[5]，最新的生物制劑如TNF-α針等應用治療RA取得了一定的進展，但還是沒有徹底治愈此類疾病。在過去的幾年，人們發現RA滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovialbroblasts,RASF)為RA病情的發展和關節破壞的關鍵因素。相關研究發現，在沒有細胞免疫和體液免疫的情況下，RASF依舊可保持其活化表型[6]并破壞軟骨，且與正常滑膜成纖維細胞的形態和基因表達模式不同[7]，表觀遺傳修飾在RA的病程變化中扮演了重要的角色。

表觀遺傳學(epigenetics)是傳統遺傳學的分支，最早由英國科學家Waddington于1942年提出[8]。其涵義為DNA序列不發生改變的情況下，基因的表達與功能發生改變，并產生可遺傳的表型，在生物體內從一代傳到另一代[9，10]。這種現象首先在植物中被發現[11],現已擴大到酵母、果蠅、小鼠和人類等[12～14]。表觀遺傳學主要有以下調節機制，即DNA甲基化[15]、組蛋白甲基化及乙酰化[16]及非編碼RNA[17]。 本文主要從RASF的表觀遺傳修飾，特別是不同的表觀遺傳修飾在RA發展中的作用進行闡述。

1 DNA甲基化與RA

DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶催化S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶的反應[18]。DNA甲基化是表觀遺傳學的一個重要修飾，在哺乳動物中DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸上，涉及整個基因組70～80%的CpG位點[19]。生物體一生中都發生著DNA甲基化模式的改變，一些變化可能是環境改變的生理反應，另外一些變化可能與惡性轉化或細胞老化等病理進程有關。

DNA甲基化模式的可繼承性使基因組的表觀遺傳標記在大量的細胞分裂過程中得以穩定，從而建立了一種細胞記憶的形式。近來研究發現，RA患者存在基因組DNA的廣泛低甲基化，尤其是滑膜成纖維細胞(RASF)內的DNA長散布核元件(LINE-1)啟動子上富含GC的CpG島序列，其發生低甲基化作用導致某些基因的異常表達，從而參與RA的全身及關節局部炎癥[20]。研究者發現，RA組織中正常沉默逆轉錄L1因子存在異常表達，用甲基化試劑5-氮-2’-脫氧胞苷培養滑膜成纖維細胞(SF)的誘導治療，揭示了DNA低甲基化在RA發病過程中起到了功能性作用[21]。基于以上跡象，研究人員對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)和類風濕關節炎組織全部DNA低甲基化進行檢測，并在低甲基化環境中培養正常滑膜成纖維細胞得到了與類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)相類似的活化表型[22]。所有DNA低甲基化被證明是由于類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)多胺代謝的增加和S-腺苷-L-甲硫氨酸水平下降所致[23]。另外，除了在RA中DNA甲基化模式有所改變外，單個基因例如趨化因子(CXC基序)、配體12(CXCL-12)的啟動子區域也發生甲基化[24]。最近研究表明，單一CpG序列中IL -6[25，26]和IL-10[27，28]基因的啟動子去甲基化與基因表達水平有關，因此有助于在疾病過程中細胞因子水平的提高，這也反映了DNA甲基化與RA發病過程中炎癥的相關起因。

分子和遺傳學研究都表明DNA胞嘧啶甲基化與沉默基因有關，并且在諸如X染色體失活、基因印記等事件中起重要作用。DNA甲基化參與RA發病機制的另一項研究主要是對女性第2個X染色體沉默進行調查，這項研究發現了在RA患者中傾斜性XCI狀態升高。而隨機XCI，至少有80%的細胞表現出相同的X染色體失活[29]，說明XCI嵌合體參與了RA的發病，并且這也可能是為什么RA在女性中更為普遍的原因。

2 組蛋白修飾與RA

組蛋白包括組蛋白 H1、H2A、H2B、H3和H4，H2A、H2B、H3和 H4組蛋白各2個分子形成1個8聚體, 組蛋白H1起到連接的作用, 把每個核小體連接到一起。組蛋白通過裝入核小體核心部分以包裝DNA，使DNA雙螺旋結構環繞其上。組蛋白在進化中進一步多樣化為各種變體，產生了具有表觀遺傳學效果的染色質分化。組蛋白修飾包括組蛋白的乙酰化與去乙酰化、甲基化與去甲基化、組蛋白的磷酸化及泛素化，這些修飾因素單一或共同作用來調節基因的表達與功能的發揮[30]。在RA中組蛋白主要通過乙酰化、去乙酰化和甲基化參與病情的發展。

組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)相互調節細胞蛋白乙酰化狀態。人類的18種HDACs已經被確定并分為4種類型(表1)，其抑制劑常被用于研究RA的發病機制。HATs和HDACs不僅針對組蛋白，而且還針對其他蛋白質如轉錄因子NF-κB和信號傳導轉錄激活因子3。這些轉錄因子在炎癥過程中扮演著重要的角色，同時參與了RA的發病過程。在對關節炎的研究中發現，與正常個體比較，RA滑膜組織中總組蛋白酶去乙酰化酶活性增加，且總滑膜組蛋白去乙酰化酶活性和HDAC1表達與TNF-α含量密切相關。TNF-α對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的刺激導致細胞滑膜組蛋白去乙酰化酶活性和HDAC1表達暫時性的增加。由TNF-α刺激的組蛋白去乙酰化酶活性與表達的時序變化與滑膜成纖維細胞因子信號蛋白相一致，包括核因子-κB-B(NF-κB)p65、JAK / STAT信號混合物、AP -1 和p53，因此在RA滑膜成纖維細胞中，組蛋白去乙酰化酶抑制劑阻止NF-κB p65的激活[31]，基因調控的表觀遺傳機制認為這有助于對免疫介導的炎癥性疾病復雜病理的認識。Nishida和他同事的研究結果證實，HDAC抑制劑FK228通過誘導P21和P16基因啟動子的乙酰化來抑制RASF的增殖[32]。高劑量的TSA和Nicotinamide可以使RA巨噬細胞誘導細胞凋亡[33]。因此，HDAC抑制劑可能對RA滑膜增生產生積極的影響：一方面通過抑制RASF的增殖，另一方面在巨噬細胞中誘導細胞凋亡。炎癥部位組蛋白去乙酰化酶活性降低與炎癥部位疾病的嚴重程度、炎癥細胞因子產生和糖皮質激素抵抗有一定的相關性，組蛋白去乙酰化酶活性降低可能有助于RA病理認識和在未來使用組蛋白去乙酰化酶抑制劑對RA患者進行抵抗治療[34]。

關節炎動物模型已證明HDAC抑制劑在體內的有益效果[32，35～38]。自身抗體介導的關節炎小鼠模型全身HDAC抑制劑FK228給藥減少了關節腫脹、滑膜炎癥和骨與軟骨的破壞[32]。在CIA關節炎大鼠和小鼠中研究了HDAC抑制劑SAHA和MS-275的預防性和治療性影響，這項研究得出HDAC抑制劑是一種創新的RA治療策略的結論[35]。在同一模型中，TSA的量效可以減少關節炎的臨床體征。筆者觀察到組蛋白H4乙酰化細胞、MMP1(TIMP1)的組織抑制因子、陽性細胞分別增加，免疫組化染色檢測到MMP3和MMP13的陽性軟骨細胞信號降低[36]。此外，HDAC抑制劑丙戊酸(VPA)能顯著降低CIA小鼠的發病率和嚴重性。這些影響通過改善CD25+FOXP3+調控的T細胞的功能來發揮作用，而CD25+FOXP3+調控的T細胞在RA患者中是有缺陷的[37]。

在RA發病機制中，除了乙酰化以外還有其他組蛋白修飾作用外，研究發現了類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)中組蛋白甲基化轉移酶(EZH2)的過度表達。EZH2是多梳基因家族抑制復合體2的催化亞基，它給特定沉默基因H3K27添加了三甲基標記物。作為一種MMTV整合位點(Wnt)信號通路抑制劑，它的過度表達導致相關蛋白分泌減少，在RA發展中起著重要作用，并與關節炎癥發病機制有一定的牽連[39]。

表1 組蛋白去乙酰化酶的分類及其抑制劑[40]

人類組蛋白去乙酰化酶(HDACs)分為4個小組。SAHA為辛二酰苯胺異羥肟酸，SIRT為sirtuin，TSA為曲古抑菌素A，VPA為丙戊酸。

3 miRNA與RA

miRNA是大小約22個核苷酸(nts)的內源性非編碼小RNA，對基因進行轉錄后調控，參與細胞增殖、分化、代謝和凋亡等過程。它通過結合靶基因的3’非翻譯區起到基因表達翻譯后的阻遏作用，這導致了翻譯過程的降解或抑制。

這些miRNA分子在沒有基因編碼序列改變的情況下能夠改變基因和蛋白的表達, 所以它們在表觀遺傳修飾中有著重要作用。對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)和骨關節炎滑膜成纖維細胞(OASF)中260個差異表達的miRNA進行篩選，發現類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)中miRNA一列數組存在過度表達，最為突出的是miR-203。RASF中miR -203的過度表達導致MMP1表達增加并提高了IL-6的分泌率[41]。另外，類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)中下調和受啟動子區域甲基化調節的miRNA是miR-34A*，miR-34A*表達下降導致了其靶點伴X染色體抑制凋亡蛋白的上調，從而有助于類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)抗凋亡表型的產生[42]。

4 總結與展望

通過對RASF中DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA的研究，我們發現表觀遺傳學與RA的病理機制密切相關。一些研究表明，表觀遺傳學對類風濕關節炎滑膜成纖細胞內在表型的激活起一定作用[43]，這些同時也可以作為動物模型中探究RA表觀遺傳學機制的數據點。現在仍舊需要更多數據來闡明何種修飾引起RA的發生，何種遺傳變化產生于慢性疾病中。雖然在RA中DNA甲基化的不同模式圖變得越來越清晰，但仍有一些表觀遺傳修飾尚未研究，或者已發現的修飾在RA發病機制中發揮何種作用。表觀遺傳學和miRNA介導的改變與疾病的研究正變得越來越重要，這些進程直接參與基因的異常表達，并最終確定細胞功能和藥理學的可逆性。

遺傳和環境因素在風濕免疫疾病中扮演著重要角色，而這兩者也在同卵雙胞胎的部分一致性中得到體現。此外，環境在確定自身免疫性疾病中起著關鍵作用。許多環境因素，包括暴露于化學品、煙草煙霧、輻射、紫外線(UV)光、傳染性病原體等其他外部因素，都與風濕免疫疾病的發展有關。目前研究表明，這些環境因素直接或間接誘發表觀遺傳與細胞功能的變化，調節基因的表達。因此，表觀遺傳學提供了一個源自分子的機制來解釋環境對自身免疫性疾病發展上的影響[44]。環境、表觀遺傳狀態和自身免疫性風濕性疾病之間的密切關系也常利用動物模型來例證，這種類型的研究為疾病的產生、發展和治療成效提供了新的臨床鑒定指標。

總之，表觀遺傳學的認識和研究已經使人類在基因方面邁上了一個新的臺階。表觀遺傳學將作為新的武器，對一些重大的和難以攻克的醫學、遺傳學難題做出解答。RA的表觀遺傳學研究任重而道遠，希望在未來對RA表觀遺傳調節機制的詳盡掌握有助于開發出新的藥物，能夠預防或者徹底根治RA。

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