三葉人字草對膠原誘導關節炎大鼠的治療及其抗氧化研究?

羅 丹,荊生龍，趙宏艷，許慧慧，周曉峰，肖 誠

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院臨研所，北京 100029；3.江西中醫學院，南昌 330004；4.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種原因不明的、慢性的、多發性的以關節對稱性損害為主要表現的自身免疫性疾病，病理表現主要在于炎細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成以及關節軟骨和骨的侵蝕與破壞等。慢性炎癥反應的持續發展，是類風濕關節炎的主要病理過程[1]，因此抑制炎癥反應就能有效地控制RA的進展。

三葉人字草(Kummerowia striata(Thunb)Schindl，Ks)為豆科雞眼草屬雞眼草，潮汕地區別名稱為鹿含草，外地別名稱為雞眼草、馬帚、蒼蠅翅等。為一年生草本，葉柄極短、一柄三葉，葉脈呈人字形排列，拉斷葉片裂口即成人字形，一年之中除冬季外，其他季節均可采摘。Ks味甘淡，入肺腎經，性微涼、無毒，主治咳嗽胸痛、暑熱口渴、小便尿血、急性胃腸炎、夜盲癥等。現代研究表明，Ks具有抗炎鎮痛作用，對炎癥后期的結締組織增生具有良好的抑制作用[2]。不同溶劑的Ks提取物均具有良好的抗氧化性，其總酚含量與DPPH 自由基清除能力有關[3]。然而目前尚未發現Ks對RA治療的相關報道，因此本研究試圖通過膠原誘導性關節炎(collagen- induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討其對RA的影響及共作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物

選用健康SPF級雄性SD大鼠，體質量160～180 g，購于軍事科學院(合格證號SCXK(京)2007-004)。飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所動物房(許可證號SYXK(京)2010-0032)。

Ks購自廣州清平藥材市場，經廣州中醫藥大學中藥學院中藥標本中心鑒定為豆科植物Ks的全草干品。稱取干燥全草加水煎煮1 h，共煎煮3次，合并煎液過濾，濾液濃縮至每100 ml相當于原生藥160 g，置于冰箱冷藏備用，臨用時用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.2 實驗儀器和試劑

LEICA CTR6000 顯微鏡(德國Leica 公司產品)；Leica-Qwin圖像分析儀系統(德國Leica 公司產品)；丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)的測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號20130128、20130123、20130124)；牛II型膠原購于美國Chondrex公司(批號101512)；不完全弗氏佐劑購于美國Chondrex公司(批號100106)。

2 方法

2.1 分組與建立模型

將50只大鼠按隨機數字表法分為正常對照組(N組)、模型組(M組)、三葉草低劑量組(KsL組)、三葉草中劑量組(KsM組)、三葉草高劑量組(KsH組)，每組10只。除N組外，其余動物制備成CIA模型。

造模方法參照[4]如下：將濃度為2 mg/ml的牛II型膠原與等體積的不完全弗氏佐劑用均質器混合均勻，操作過程均在冰上進行。大鼠的尾根部75%酒精消毒后，于尾根部皮下注射上述終濃度為2 mg/mL的乳劑0.2 ml，N組大鼠同部位注射等體積的生理鹽水。7 d后，在相同部位再次免疫，劑量為0.1 ml。第2次免疫后約1周左右出現多發性關節炎。

2.2 給藥

于第2次免疫后1周，各給藥組大鼠分別按70 kg成人等效劑量給予Ks低劑量(4 g生藥/kg)、中劑量(8 g生藥/kg)、高劑量(16 g生藥/kg)，每天1次灌胃給藥；N組大鼠給予等量生理鹽水。給藥時間均固定在每天9時，給藥周期為4周。

2.3 關節腫脹度的評定

于第1次免疫后14 d每隔5 d即第1、6、11、16、21天和第26天對大鼠左右后足關節紅腫程度進行關節炎指數(Arthritis Index，AI)評定，累積評分最高為8分，標準如下[5～7]：0分：無關節炎；1分：個別足趾發紅、腫脹；2分：大部分足趾及足底腫脹；3分：踝關節以下全部腫脹；4分：腫脹累及踝關節以上且不能負重。

2.4 大鼠踝關節病理學觀察

取大鼠的踝關節多聚甲醛固定36 h后入10% EDTA脫鈣，酒精逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察踝關節的病理學改變，包括滑膜增生、血管翳生成、炎細胞浸潤、軟骨及骨的病理改變等。

2.5 檢測血清MDA、T-AOC、T-SOD

按照試劑盒說明書操作，硫代巴比妥酸法測定MDA，鐵還原法測定T-AOC，羥胺法測定T-SOD。

3 統計學方法

4 結果

4.1 大鼠AI的變化

表1顯示，隨著給藥時間的延長，3個給藥組大鼠AI積分都明顯下降。從第16天開始， KsH組的AI積分與M組比較顯著降低(P<0.01)，其作用一直持續到第26天(P<0.01)。與M組比較，KsL組、KsM組也有下降趨勢，但差異無統計學意義。

表1 各組大鼠AI 的變化

注：與N組比較：*P<0.05，**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01(下同)

4.2 大鼠踝關節的病理學改變

病理學圖片顯示，N組關節結構、軟骨和關節周圍軟組織未見異常，滑膜組織無增生。M組關節內可見明顯的滑膜組織增生，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。關節面完全破壞，增生的滑膜和血管形成血管翳浸入軟骨或骨組織，軟骨表層可見明顯的壞死，關節腔內也可見壞死剝脫的軟骨和滑膜組織。KsL組滑膜組織增生、炎性細胞浸潤及關節破壞無明顯改善。KsM組滑膜組織的增生和炎性細胞浸潤略有減少，可見關節面明顯的破壞；KsH組滑膜增生和滑膜組織水腫明顯減輕，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤減少，血管新生顯著減少，血管內膜增厚減輕，少見血管翳形成，關節面破壞減輕。

圖1 各組大鼠踝關節的病理變化(A)N組；(B)M組；(C)KsL組；(D)KsM組；(E)KsH組。(HE，100×)

4.3 大鼠血清MDA含量、T-AOC和T-SOD活性的變化

表2顯示，與N組比較，M組中的MDA含量、T-AOC和T-SOD活性差異有統計學意義(P<0.01)。與M組比較，各治療組MDA含量明顯降低(P<0.05)，KsH組的T-AOC活性顯著升高(P<0.05)，KsM組、KsH組T-SOD的活性顯著升高(P<0.01)，但各治療組之間差異無統計學意義。

表2 各組大鼠血清MDA含量、T-AOC和T-SOD活性的變化

5 討論

RA是影響多個關節的慢性病，滑膜組織的增生和炎性細胞的浸潤又是其主要病理特點，由此而形成的血管翳能對受影響關節的軟骨和骨造成不可逆轉的破壞。而本研究中所采用的CIA大鼠模型與人類RA在許多方面相似，因此它被普遍用作中藥治療RA的研究模型[4, 8]。

氧自由基是細胞代謝的產物，在生理條件下發揮第二信使的作用，但在RA存在時，氧自由基會過度表達，對細胞組織等產生毒性作用，是造成組織損傷的主要因素之一，也會影響到RA病人對治療的反應[9～11]。SOD是體內抗氧自由基的重要生理防線，能夠有效地清除體內自由基，對體內的氧化/抗氧化系統穩定有著十分重要的作用。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化而形成的脂質過氧化產物，脂質過氧化產物與蛋白中賴氨酸殘基反應產生免疫原性分子，從而加劇炎癥，而較長鏈的多不飽和脂肪酸尤其能增強脂質過氧化反應和導致細胞損害的氧化應激[12]，而對T-AOC的檢測又能客觀反映機體內抗氧化酶類的濃度。因此，增強抗氧化能力將能有效緩解RA[4]。而現代研究證實，Ks中黃酮、多糖、氨基酸和多酚具有較強清除自由基的能力，對DPPH 自由基和羥自由基的清除率表現為顯著的量效關系[13]。Ks對IgA腎病模型也具有很好的抗氧化活性，能夠清除自由基，提高抗氧化酶活力[14]。

在本研究中，觀察到M組的血清MDA含量明顯升高，同時降低了血清T-AOC和T-SOD活性，具有顯著的氧化效應，而關節的AI值和病理學圖片也顯示關節的炎癥程度較重，相反，經Ks治療后，關節的炎癥程度得到降低，尤其KsH組抗氧化效果明顯，對CIA模型能降低其MDA含量，提升T-AOC和T-SOD活性，關節的病理學圖片顯示滑膜組織的增生和炎性細胞的浸潤減少，軟骨及骨損傷等也出現明顯緩解。因此本研究結果提示，Ks可能通過有效的抗氧化效應，對抗氧自由基來達到一定的緩解和治療RA的目的，其具體機制值得進一步研究。

[1] YifanW,Dengming W, Zheng L, et al. Triptolide inhibits CCR5 expressed in synovial tissue of rat adjuvant-induced arthritis[J]. Pharmacol Rep, 2007， 59(6): 795-799.

[2] 周玖瑤, 黃桂英,韓堅. 三葉人字草抗炎鎮痛作用研究[J]. 中國醫藥導報, 2007, 2(4): 155-156.

[3] 蘇煒,李培源, 霍麗妮,等.三葉人字草抗氧化活性研究[J].時珍國醫國藥, 2011，10(22): 2438-2439.

[4] XiaoC, Li J, Dong XX, et al.Anti-oxidative and TNF-alpha suppressive activities of puerarin derivative (4AC) in RAW264.7 cells and collagen-induced arthritic rats[J]. Eur J Pharmacol, 2011,666(1-3): 242-250.

[5] KawahitoY,CannonGW,Gulko PS, et al.Localization of quantitative trait loci regulating adjuvant-induced arthritis in rats: evidence for genetic factors common to multiple autoimmune diseases[J]. J Immunol, 1998,161(8): 4411-4419.

[6] Meng HC, Griffiths MM, Remmers EF，et al., Identification of two novel female-specific non-major histocompatibility complex loci regulating collagen-induced arthritis severity and chronicity, and evidence of epistasis[J]. Arthritis Rheum, 2004,50(8): 2695-2705.

[7] Remmers EF, Longman RE, Du Y, et al.A genome scan localizes five non-MHC loci controlling collagen-induced arthritis in rats[J]. Nat Genet, 1996,14(1): 82-85.

[8] Xiao C, Zhao LH, Liu ZL, et al., The effect of triptolide on CD4+and CD8+cells in Peyer’s patch of DA rats with collagen induced arthritis[J]. Natural Product Research, 2009,23(18):1699-706.

[9] SurapneniKM, VSChandrasada Gopan. Lipid peroxidation and antioxidant status in patients with rheumatoid arthritis[J]. Indian J Clin Biochem, 2008, 23(1): 41-44.

[10] Halliwell B, MGrootveld.The measurement of free radical reactions in humans. Some thoughts for future experimentation[J]. FEBS Lett, 1987,213(1): 9-14.

[11] Di Cesare Mannelli L, Bani D, Bencini A, et al.Therapeutic Effects of the Superoxide Dismutase Mimetic Compound Mn(II)Me2DO2A on Experimental Articular Pain in Rats[J]. Mediators Inflamm, 2013,article ID:905360.

[12] Darlington LG , TWStone.Antioxidants and fatty acids in the amelioration of rheumatoid arthritis and related disorders[J]. Br J Nutr, 2001,85(3): 251-269.

[13] 李南薇,繆科亦.人字草功能性成分的抗氧化活性研究[J].食品工業科技, 2013, 3(34):128-131.

[14] 王霞,周玖瑤, 孫毅東. 三葉人字草對IgA腎病模型大鼠的影響[J].廣州中醫藥大學學報, 2010,2 (27): 147-150+155.