養陰生肌膜對大鼠實驗性口腔潰瘍的治療作用?

李喜香，禚 君，豆金彥，劉軍剛，高小恒，黃清杰

(甘肅省中醫院，蘭州 730050)

口腔潰瘍是常見的口腔黏膜疾病，發病率為20%[1]，表現為口腔灼燒痛、潰爛，呈周期性、游走性反復發作難于治愈，直接影響患者的進食、吞咽和說話等日常生活。其潰瘍面成圓形或卵圓形，凹陷且周圍充血，創面刺激引發疼痛，現代醫學對其尚無較好的治療方法。研究發現[2]，免疫功能紊亂是口腔潰瘍發生的最重要原因，感染、遺傳、微量元素(鋅、鐵)和維生素VitB12缺乏、口腔黏膜局部微循環障礙和精神神經功能紊亂等諸多因素均可導致該病的發生和加重。養陰生肌膜是對養陰生肌散劑型改造而制得的膜劑[3]。前期研究發現，養陰生肌膜對口腔潰瘍模型大鼠具有一定的治療作用[4]。本文進一步研究養陰生肌膜對大鼠實驗性口腔潰瘍的治療作用，并探討其作用機理。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠140只，SPF級，雌雄各半，體質量200±20 g,由甘肅中醫學院科研實驗中心提供(合格證號SCXK(甘)2011-0004)。

1.2 藥品與試劑

養陰生肌膜，甘肅省中醫院制劑中心；苯酚，天津市天驕制藥有限公司(批號000126)；乙醚，天津市中建化工有限公司(批號20120106)；甲醛，上海金泓化工有限公司(批號20110925)。大鼠TNF-a酶聯免疫試劑盒、IL-2酶聯免疫試劑盒，均由南京建成生物制品有限公司提供(批號20130902-01)。

1.3 主要儀器

電子天平(德國sartorius)，TGL-16G高速低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)， OLMPUS顯微鏡(奧林帕斯公司出品)，大恒細胞分析系統(中國大恒集團有限公司)，TEC5組織包埋機(北京怡康勇佳科技有限責任公司)，全自動密閉式組織脫水機(北京怡康勇佳科技有限責任公司)，RM2135石蠟切片機(德國Leica 公司)，SP-Max 2300A酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型復制

取大鼠84只，隨機預留14只為空白對照組，其余大鼠參考文獻[5]并改進方法，用醫用乙醚吸入麻醉，取一直徑為5 mm的塑料管，將小棉球(約20 mg)用30 μL 95% 的苯酚溶液浸透后置于塑料管一端(與塑料管管口取平)，將塑料管置于麻醉大鼠左側頰黏膜上，保留60 s，用生理鹽水清洗灼燒面。24 h 后觀察，左側實驗區形成直徑約3 mm的圓形潰瘍，表面有黃白色膿腫，與周邊分界明顯，周圍黏膜紅腫充血，表明模型復制成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組(氯已定地塞米松口腔潰瘍膜)、養陰生肌膜高、中、低劑量組5組，每組14只。空白對照組正常飲食飼養，不做任何干預；模型對照組每日1次給予生理鹽水沖洗；其余各組分別進行藥物干預，乙醚吸入麻醉后，將藥膜貼于潰瘍面處，保持5 min，直至藥膜溶化后，生理鹽水沖洗。陽性對照組給予5×5 mm2復方氯已定地塞米松膜，養陰生肌膜高、中、低劑量組分別給予5×5 mm2養陰生肌膜(按文獻[3]制備，每25 mm2分別含藥78.6、39.3、19.6 mg)，給藥后1 h內禁食禁水，每日給藥1次，連續8 d。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 潰瘍面[6]造模后每日觀察大鼠潰瘍面基本形態，測量潰瘍面直徑，于給藥第2、4、6、8天用透明玻璃紙描記潰瘍面，用 Image-pro Plus 圖像分析軟件測量其面積大小。

2.3.2 平均愈合速度 每日拍照記錄大鼠潰瘍面愈合情況，記錄每只大鼠潰瘍完全愈合時間，計算各組平均愈合時間及平均愈合速度。平均愈合速度( mm2/d)=潰瘍面積(mm2)/愈合時間(d)。

2.3.3 血清TNF-a 和 IL-2 含量 末次給藥后1 h，各組大鼠麻醉后腹主動脈采血，4 ℃靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒操作步驟分別測定血清TNF-a 和 IL-2 含量。

2.3.4 組織病理學檢查 第4天和第8天給藥后1 h，隨機抽取各組大鼠4只，麻醉后剪取潰瘍部位組織，用無菌生理鹽水沖洗，4%中性多聚甲醛固定，梯度脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下進行病理組織學觀察。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 養陰生肌膜對潰瘍愈合面積的影響

表1顯示，與模型對照組比較，給藥第4、6、8天養陰生肌膜高、中劑量組的潰瘍面積縮小明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 大鼠口腔潰瘍面積變化情況

注：與模型對照組比較:**P<0.01，*P<0.05

3.2 養陰生肌膜對口腔潰瘍平均愈合時間及速度的影響

表2顯示，與模型對照組比較，養陰生肌膜高、中劑量組大鼠口腔潰瘍平均愈合時間明顯縮短，平均愈合速度明顯加快，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。

表2 潰瘍平均愈合時間及速度比較

注：與模型對照組比較：**P<0.01，*P<0.05

3.3 養陰生肌膜對血清TNF-a 和 IL-2 水平的影響

表3顯示，與空白對照組比較，模型對照組血清 TNF-α水平明顯升高，血清IL-2水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；與模型對照組比較，養陰生肌膜高、中劑量組血清TNF-α明顯降低，IL-2 水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

3.4 組織病理學改變

給藥第4天，空白對照組大鼠口腔黏膜形態正常，未見組織壞死和上皮細胞缺損，未見充水和炎性細胞浸潤；模型對照組病灶區多見組織壞死，表層鱗狀上皮缺失，滲出物多，固有層及肌層組織明顯充血水腫，大量中性粒細胞、淋巴細胞、吞噬細胞浸潤；陽性對照組病灶區表層上皮及固有層壞死，大量炎細胞浸潤，新生的肉芽組織形成，血管豐富，肌層可見肌細胞變性、壞死，部分肌纖維增粗，肌細胞核內移；養陰生肌膜高劑量組病灶區表層上皮壞死缺失，滲出物多，組織水腫明顯，大量炎細胞浸潤。固有層淺層壞死，新生肉芽組織形成，血管豐富；中劑量組程度較重；低劑量組病灶區大片組織壞死明顯，表層上皮缺失，滲出物多，固有層及肌層組織明顯充血水腫，大量炎細胞浸潤(見圖1)。

表3 養陰生肌膜對血清TNF-α、IL-2水平的影響

注：與空白對照組比較：##P<0.01，#P<0.05；與模型對照組比較：**P<0.01，*P<0.05

圖1 給藥第4 d各組大鼠口腔黏膜組織病理學變化

給藥第8天，空白對照組大鼠口腔黏膜形態正常，模型對照組病灶區新生上皮組織部分處于分離狀態，尚未完全覆蓋，滲出物基本消失，固有層中肉芽組織仍較豐富，炎細胞浸潤，可見中性粒細胞、纖維母細胞增生。肌層中肌細胞核大、淡染，處于增生階段。組織中血管較大，血細胞較多；陽性對照組和養陰生肌膜高劑量組病灶區新生上皮組織完整覆蓋，肉芽組織已轉化為瘢痕組織，肌肉層修復完全，未見炎細胞；中劑量組病灶區新生上皮組織完全覆蓋，固有層為瘢痕組織，血管減少，纖維母細胞增生，膠原纖維豐富，肌層修復完整；低劑量組新生上皮組織尚未完全覆蓋，固有層中炎細胞浸潤明顯，血管較多，肉芽組織仍存在，纖維母細胞增生，可見肥大細胞。肌層肌纖維粗細不一，仍處于增生階段(見圖2)。

圖2 給藥第8天各組大鼠口腔黏膜組織病理學變化

4 討論

細胞因子在復發性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)發病炎癥損傷及其抗炎修復中具有非常重要的意義[7]。機體受到侵襲時，釋放炎癥因子引起炎癥反應，同時產生一系列抗炎因子，以維持機體的平衡穩態，能有效減少ROU的復發，減輕患者的痛苦。白細胞介素、干擾素、TNF-β、生長因子、集落刺激因子等的表達，其他一些外界、機體的因素都可能會影響 ROU 的發生發展，TNF-α 和 IL-2 表達水平的改變對 ROU 有一定的療效[8]。TNF-α 是ROU發病中很重要的損傷性細胞因子之一[8，9]，炎性細胞所分泌的 TNF-α 能進一步損傷組織，放大炎癥反應。因此抑制 TNF-α 的合成、分泌，能有效地抑制局部炎癥反應。IL-2 可以有效改善 ROU 患者的細胞免疫功能，是促進 T 細胞由 G1 期進入 S 期最重要的細胞因子，并具有促進 B 細胞增殖、分化、合成抗體，誘導許多細胞因子產生和細胞因子受體表達等生物學功能，同時 IL-2 受體的表達可活化外周血淋巴細胞，調節復發性口腔潰瘍患者 IL-2 的血漿水平，增強口腔黏膜抵抗病原微生物的能力，促進潰瘍面的愈合。養陰生肌膜能顯著降低 TNF-α 水平，同時也能明顯提高 IL-2水平。本研究結果表明，養陰生肌膜組大鼠口腔潰瘍上皮細胞損傷減輕，直徑明顯縮小，癥狀明顯緩解，這可能與TNF-α、IL-2水平的改變有關。

[1] 梁文紅, 劉建國, 郭玉蘇,等. 茶多酚對復發性阿弗它潰瘍大鼠模型外周血 T 淋巴細胞亞群的影響[J] .口腔醫學研究, 2005, 21( 4):393-395.

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[3] 李喜香,羅燕梅,羅文蓉,等.養陰生肌膜工藝條件的篩選[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(8):43-45.

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[5] 朱萱萱,王廣基,劉建平,等.口腔膜治療實驗性大鼠口腔潰瘍作用機理研究[J].中醫藥學刊,2003,21(1):84-85.

[6] 陳嶸, 葉楠, 周威. 蘆薈液- 表皮生長因子復合醫用膠促進大鼠口腔潰瘍愈合的研究[ J] .牙體牙髓牙周病學雜志,2009, 19 (8):449-450.

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