益腎通絡方對大鼠長期毒性研究*

金 一，楊 智△，金 紅，凌 曉，馬 征，鄒晨曦，蔣 娜

(1.湖南師范大學醫學院，長沙 410013;2.湖南省疾病預防控制中心，長沙 410005)

益腎通絡方由黃芪、制首烏、當歸等中藥組成，具有補腎化瘀的作用。臨床及實驗研究表明，對腎病綜合征腎虛夾瘀證有較好的治療效果[1～3]。為給臨床用藥提供安全依據，根據國家新藥相關法規和技術規范[4，5]，筆者對益腎通絡方進行了長期毒理作用研究，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague Dawley(SD)大鼠由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部提供(生產許可證號SCXK(湘)2009-0012)。6～9周齡SD大鼠80只，體質量150±20 g，雌雄各半。

1.1.2 藥物 益腎通絡方組成藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。采用益腎通絡方流浸膏:將上述藥材按比例混合后加入85℃左右的水浸沒，熱浸0.5 h后煎煮1 h，過濾，藥渣再加85℃左右的水浸沒，煎煮30 min，過濾并合并煎液。將上述煎液在65℃下濃縮至2.5 g/mL，即得到益腎通絡方流浸膏。

根據《中藥新藥研究指南》用藥量以成人的臨床用量推算動物用量，根據人與大鼠用藥劑量換算法計算，并根據前期藥效學實驗結果。具體如下:(1)益腎通絡方高劑量(50 g/kg);(2)益腎通絡方中劑量(25 g/kg);(3)益腎通絡方低劑量(12.5 g/kg)。

1.1.3 主要儀器及試劑 瑞士Büchi R-220旋轉蒸發儀，日本Olympus AU400全自動生化分析儀，美國雅培CD3700全自動血球計數儀，英國珊頓Finesse325旋轉石蠟切片機，日本Olympus BX41TF系統顯微鏡等。Cr(Creatinine，Cr)試劑盒購自上海申能-德賽診斷技術有限公司，其他試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及給藥 將80只SD大鼠按隨機數字表法分為益腎通絡方高劑量組(50.0 g/kg)、中劑量組(25.0 g/kg)、低劑量組(12.5 g/kg)和空白對照組，每組20只。單籠飼養，先于實驗室飼育1周，觀察各組動物體征、體質量、毛發、進食、糞便無異常后，分組按劑量每日經口灌胃給藥。益腎通絡方高劑量組灌服50 g/kg益腎通絡方浸膏水溶液，中劑量組灌服25 g/kg浸膏水溶液，低劑量組灌服12.5 g/kg浸膏水溶液，按2 ml/100 g灌胃給藥1次;空白對照組灌服等體積蒸餾水。大鼠每周稱體質量1次，根據體質量情況調整藥量，連續觀察13周。

1.2.2 指標檢測 (1)一般情況觀察:單籠飼養，自由攝食飲水，試驗期間觀察動物的活動和生長情況，每周加食2～3次，記錄給食量和剩食量，每周稱1次體質量，計算食物利用率。每日觀察記錄精神狀態、活動情況、飲食、二便、毛發光澤度、體質量等;(2)血液學指標:13周末次給藥后，每組取14只，雌雄各半，12 h禁食不禁水，乙醚麻醉后舌下采血至抗凝管和非抗凝管，采集的血樣于血細胞分析儀上檢測紅細胞或網織紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細胞計數(WBC)血小板(PLT)、白細胞分類等血液學指標;(3)血液生化學指標:采集的血樣于非抗凝管血分離血清后，于生化自動分析儀上測定血清中的門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、丙氨酸氨基轉換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白 (ALB)、血糖 (GLU)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮 (BUN)、肌酐 (Gr)、總膽固醇(CHOL)等生化學指標;(4)病理組織學檢查:采血后頸椎脫臼處死動物，對主要臟器進行全面尸檢，取肝、脾、腎、睪丸等臟器稱重并計算臟器系數;然后對上述主要臟器及胃、小腸、子宮、卵巢、睪丸、腦等臟器用10%甲醛固定進行常規病理學檢查;(5)各組余下大鼠停藥觀察2周后同樣處理，并檢測上述指標。在對益腎通絡方各劑量組動物作大體檢查未發現明顯病變和生化指標改變時，只進行高劑量組及空白對照組動物主要臟器的組織病理學檢查，發現病變后再對較低劑量組相應器官及組織進行檢查。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，各組數據以均數±標準差(s)表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 一般情況

各組動物在灌胃給藥后，由于灌胃刺激出現輕度不適，但很快恢復正常。試驗期間各組大鼠無死亡，益腎通絡方中、高劑量組動物出現不同程度的排便量增多，高劑量組表現明顯，糞便稀軟，呈大顆粒或條狀，試驗后期出現腹瀉癥狀。

2.2 生長狀況、進食量及食物利用率

表1、2顯示，益腎通絡方各劑量組動物體質量增長緩慢，從第7周開始高劑量組動物體質量與空白對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。試驗末高劑量組動物增重減少，總攝食量和食物利用率降低，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 益腎通絡方對大鼠體質量的影響

2.3 血液學和血生化檢查

表3～5顯示，各劑量組動物的血液學檢查和各項臨床血生化指標均在實驗室正常范圍內，給藥期和恢復期與空白對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 益腎通絡方對大鼠體質量、進食量、食物利用率的影響

2.4 臟器系數

表6顯示，試驗末尸檢肉眼觀察各臟器無明顯異常并未見病變，益腎通絡方各劑量組肝/體、脾/體、腎/體和睪丸/體比值給藥期和恢復期與空白對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，所有變化在正常范圍內。

2.5 病理組織學檢查

大體觀察:各組大鼠胸腺、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、回腸、直腸、睪丸(或卵巢)未見異常，也未見膀胱、肝總管結石。組織學觀察:對益腎通絡方高劑量和空白對照組進行組織病理學檢查，動物肝臟被膜完整，肝小葉結構清楚，肝細胞索排列整齊;腎臟被膜完整，腎小球、腎小管結構正常、腎間質無異常;胃腸壁各層結構清楚，黏膜上皮完整，黏膜下各層未見充血、水腫、炎性細胞浸潤;脾臟被膜完整，脾小梁結構正常，紅、白髓比例正常，無炎性細胞浸潤及色素沉著;睪丸曲精管內各級生精細胞發育良好，間質未見水腫、出血、炎性細胞浸潤;卵巢上皮與白膜正常，各級卵泡發育良好，間質未見瘀血和炎性細胞浸潤。

表3 益腎通絡方對大鼠血常規的影響

表4-1 給藥期益腎通絡方對大鼠生化指標的影響

表4-2 給藥期益腎通絡方對大鼠生化指標的影響

表5-1 第15周末益腎通絡方對大鼠生化指標的影響

表5-2 第15周末益腎通絡方對大鼠生化指標的影響

表6 益腎通絡方對大鼠器官/身體質量量比影響

3 討論

益腎通絡方經臨床多年運用及前期藥效學研究均證實，對腎病綜合征腎虛夾瘀證有明顯療效。前期實驗研究還顯示，該復方對脂多糖誘導的大鼠腎小球細膜增殖有明顯的抑制作用[6]。本試驗以益腎通絡方的高、中、低3個灌胃劑量50.0、25.0、12.5 g/kg均遠遠高于推薦的臨床給藥劑量2.35 g/kg，其中高劑量組達到臨床給藥量的20倍，給藥時間90 d，也長于臨床給藥時間15～30 d。

本實驗顯示，連續給藥90 d后，益腎通絡方50.0 g/kg劑量組大鼠的體質量從第7周開始與空白對照組比較顯著下降，而各劑量組大鼠的血常規及血清生化指標與空白對照組比較差異無統計學意義，說明益腎通絡方對大鼠的生長及各項生理指標無明顯病理影響。本試驗中，剖檢和病理組織學觀察心、肝、脾、肺、腎、胃和腸功能均正常，說明益腎通絡方對大鼠臟器無明顯損傷。

以上結果表明，益腎通絡方按照推薦的給藥劑量和給藥療程服用，其長期毒性不明顯，臨床應用安全。

[1]盧岳華，陳小光，金紅，等.補腎通絡方治療腎病綜合征的臨床觀察[J].湖南中醫藥大學學報，2007，27(6):47-49.

[2]金紅，楊智，劉慧萍，等.益腎通絡方對C-BSA腎病綜合征大鼠模型的整體治療作用[J].遼寧中醫雜志，2008，35(10):1597-1600.

[3]金紅，李雅，凌曉，等.健康大鼠服用益腎通絡方后血清中阿魏酸的RP-HPLC測定[J].湖南師范大學學報(醫學版)，2007，4(4):9-10，13.

[4]國家食品藥品監督管理局.中藥、天然藥物長期毒性試驗技術指導原則[S].2005.

[5]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].2版.北京:人民衛生出版社，2006:107-113

[6]金紅，易宇新，盧岳華，等.益腎通絡方對體外大鼠腎小球系膜細胞增殖的抑制作用[J].中國中醫基礎醫學雜志，2008，14(7):505-506.