頸康片對退變頸椎間盤髓核超微結構影響的實驗研究?

林石明,李兆文,陳魯峰,林俊山,趙學田,王瑞國,林向前,陳聯源,許書亮,周琳英

(1.福建省漳州市中醫院,漳州 363000;2.福建中醫學院骨傷系,福州 350003；3.福建醫科大學電鏡室,福州 350003)

頸椎病是由于頸椎間盤退變、突出、節段性不穩定、骨質增生或骨贅形成等原因在椎管內或椎間孔處刺激和壓迫脊髓、頸神經根、椎動脈等組織，導致患者出現頸部疼痛、肩臂手麻木、頭痛、眩暈甚至癱瘓等癥狀，其中神經根型頸椎病是發病率最高的1種類型，約占60%～70%，好發于中老年人，多見于40～60歲人群，嚴重影響患者的日常生活與工作。對于該病的治療，目前西醫大多采用非甾體抗炎藥止痛和營養神經等對癥治療，遠期療效欠佳，且由于止痛藥對胃腸的副作用，一部分患者無法耐受。頸椎病屬于中醫學“痹證”范疇，采用中醫藥治療取得一定療效，且沒有毒副作用。我院根據老中醫驗方頸痛寧研制而成頸康片，用于治療神經根型頸椎病10余年取得顯著療效，并未發現毒副作用[1]。我們經過系列實驗研究[2～4]證實，該藥使用安全，具有抗炎鎮痛、改善微循環作用，同時對頸椎間盤髓核炎癥介質能夠起到干預作用。由于神經根型頸椎病的發病基礎是頸椎間盤退行性改變所致，故本實驗采用透射電鏡從細胞水平及亞細胞水平觀察頸康片對退變頸椎間盤髓核超微結構的影響，以初步探討該藥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6個月齡新西蘭兔28只，雌雄各半，體質量2.5～3.0 kg，由浙江省實驗動物中心提供(實驗動物合格證書號96(001)號)，醫學實驗動物環境設施為兔類實驗室清潔級(合格證書號醫動學第 98(001)號)。

1.2 實驗藥物

頸康片(閩藥制字Z06602035)原藥材由漳州市醫藥公司統一購進，由漳州市中醫院制藥廠負責加工制備，1 ml含生藥3.6 g(批號001009)；頸復康由承德中藥集團有限責任公司提供(批號080193)。

1.3 實驗儀器

透射電鏡，Hu-12A型,日本產;醫用X線診斷機，300 mA 國產(北京);Olympus 萬能顯微鏡，BH-2型,日本產;石蠟切片機，CUT4060型,德國產。

1.4 動物造模、分組、給藥、取材

1.4.1 分組及造模 28只6月齡新西蘭兔雌雄各半，適應性喂養1周后，按隨機數字表法分成模型組20只，正常對照組8只。編號后分籠飼養，自由攝食飲水，喂以標準顆粒飼料，保持飼養房濕度60%～80%，濕度適宜24 ℃～28 ℃，通風良好，采光條件可。

造模方法參照文獻[4～6]進行，模型組用鹽酸氯胺酮肌注麻醉(0.1 g/kg)后，取俯臥位于手術桌上，頸部剪毛消毒后，取頸部后正中切口，自枕外粗隆至胸1，長約8～10 cm，逐層切開皮膚、皮下組織，找出項韌帶將其切除，自椎板往兩側剝離椎旁肌肉，將其部分切斷，然后將頸椎棘間韌帶切斷，仔細止血后，觀察無活動性出血點，逐層縫合。術后肌注慶大霉素1次預防感染(4萬U/只)。1周后傷口愈合，即將模型組新西蘭兔關進特制低頭位兔籠中，每天2次，每次2 h，持續8周。術后8周，模型組及正常對照組各處死2只新西蘭兔，然后將模型組分為頸康片組、頸復康組及生理鹽水組，每組6只。

1.4.2 給藥及取材 術后8周，頸康片組及頸復康組開始給藥，用藥劑量按《動物體表面積比率換算等劑量法》，由正常人每日常用劑量換算得出。頸康片組給藥量為3.6 g/kg·d，頸復康組給藥量為4.0 g/kg·d，給藥前選用生理鹽水將頸康片浸膏配成0.36 g/ml溶液，頸復康沖劑配成0.4g/ml溶液，采用灌胃法給藥每天1次，按10 ml/kg·d喂食藥物；而生理鹽水組及正常對照組分別按10 ml/kg·d灌服生理鹽水，連續喂食4周。

術后4、8周后進行頸椎拍片檢查，術后8周模型組及正常對照組各處死2只新西蘭兔，取頸4-5椎間盤髓核組織進行顯微鏡觀察。給藥4周后處死全部新西蘭兔，取出頸4-5椎間盤髓核，每組取2個頸4-5髓核，經固定、切片等處理后進行透射電鏡觀察。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 頸椎X線攝片檢查 正常對照組與模型組新西蘭兔均于術后4周、8周采用鹽酸氯胺酮肌注麻醉后拍攝頸椎側位X線片。

1.5.2 透射電鏡觀察髓核超微結構 取頸4-5椎間盤髓核約1mm3，經過前固定、漂洗、后固定、系列脫水、包埋、染色及切片后上銅網，于日立Hμ-12A電子顯微鏡下觀察軟骨細胞、膠原纖維超微結構。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 X線片檢查結果

各組新西蘭兔均于術后4周及術后8周在同樣攝片條件下拍攝頸椎側位X線片(圖1～4所示)，參照余氏評分法[3]觀察椎間孔縮小程度、生理弧度改變、椎間隙是否變窄、椎體前后緣骨質有無增生、頸椎上下關節突骨質有無增生等方面，對X線片進行評分。

圖1 正常對照組頸椎側位片圖

圖2 模型組實驗4周頸椎曲度反弓

圖3 模型組實驗8周頸椎曲度變平，頸4椎體前緣增生

圖4 模型組實驗8周椎間隙明顯狹窄，頸4-5 前緣增生，后關節間隙模糊

組 別4周8周模型組210±097﹡440±164＊＊﹟正常對照組150±105150±105

注：術后4周與正常對照組比較：﹡P>0.05; 術后8周與正常對照組比較：﹡﹡P<0.01; 術后8周與4周對比：﹟P<0.01

表1顯示，術后4周模型組頸椎X線片評分與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明造模4周造模組頸椎退變不明顯。術后8周，模型組與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；造模組術后8周與術后4周比較差異有統計學意義(P<0.01)，表明造模8周模型組退行性改變非常明顯，具有統計學意義。

2 超微結構觀察

2.1 正常對照組

膠原纖維排列較有規則，分布密度較均勻，原纖維的粗細及相互間距大致相同，軟骨樣細胞呈橢圓形、短梭形或核橢圓形，胞漿內有粗面內質網、線粒體、糖原等細胞器。有的細胞周圍見細胞周質，主要由細絲及顆粒狀物質組成 (圖5a、b)。

2.2 生理鹽水組

病變重、膠原原纖維多數已溶解，僅殘余一些定形物質，軟骨樣細胞已壞死，巢內僅留有電子密度高的細胞碎渣。有些壞死軟骨樣細胞的細胞周質仍可見，有些細胞周質亦溶解 (圖6a、b、c、d)。

圖5a 正常對照組髓核軟骨細胞(×7000)

圖5b 正常對照組膠原纖維(×7000)

2.3 頸康片組

病變中等，多數膠原原纖維排列較規則，部分區域膠原原纖維變性為團塊狀高電子密質物，個別區域膠原原纖維有溶解，局部殘余小空隙或為無定形物質充填。絕大多數軟骨樣細胞改變輕，僅見細胞內線粒體等細胞器略有腫脹，有些軟骨樣細胞結構基本正常，壞死的細胞少見，但幾乎大部分細胞的細胞周質明顯增厚并變性，見一些塊狀高電子密度物質堆積(圖7a、b)。

2.4 頸復康組

病變仍較重，部分膠原原纖維排列稀疏、較紊亂，部分膠原原纖維溶解，局部殘余較大的空隙或殘余一些無定形物質，絕大多數軟骨樣細胞壞死，偶見一些結構尚可的軟骨樣細胞，但其胞漿內脂肪滴有增多，線粒體有腫脹，有的軟骨樣細胞的細胞周質增厚明顯(圖8a、b)。

圖6a 髓核軟骨細胞壞死 (×3600)

圖6b 髓核軟骨細胞裂解壞死(×4800)

圖6c 膠原纖維稀疏、排列不整齊(×6000)

圖6d 膠原纖維扭結成毛線團狀(×15200)

圖7a 頸康片組髓核軟骨細胞輕度退變(×4000)

圖7b 膠原纖維排列較規則，但部分斷裂(×4800)

圖8a 頸復康組髓核軟骨細胞輕度退變(×7000)

圖8b 膠原纖維排列輕度紊亂，部分斷裂(×6000)

3 討論

3.1 關于頸椎病動物模型的建立

頸椎病發病機制復雜，故復制其模型較困難。目前國內外學者通過多種方法復制其模型，并對其發病機理進行了諸多探討。Whitehill[7]通過損傷狗的前縱韌帶纖維環和所有后部韌帶結構造成頸椎不穩，術后3個月成模，并從放射學、生物力學及組織形態學方面對模型的恢復進行研究。Miyamoto[8]通過分離鼠脊柱后部附著于椎體的肌肉及切除棘突、棘上韌帶和棘間韌帶來造成頸椎病的模型，術后6～12月成模，并首次從病理學上證實頸椎病模型的成立。彭寶淦[5]通過切除兔頸棘上、棘間韌帶和分離椎旁兩側的肌肉，3個月后建立頸椎病模型，并通過X線攝片檢查及顯微鏡觀察證實模型的成立。余家闊等[6]根據長期低頭伏案工作的人易得頸椎病的情況，將家兔放入特制的低頭位兔架中，每次低頭2 h，每天2次，2個月后建立了頸椎病模型。此外，施杞等[9]根據中醫病因學說，將風寒濕的刺激引入頸椎病造模過程中。實驗中觀察到，長期低頭體位可造成頸部肌肉變性，加之風寒濕的不斷刺激，加重了頸椎退行性改變。彭寶淦等[5]對頸椎病動物模型的椎間盤進行了形態學研究，在普通顯微鏡下見3個月造模組椎間盤纖維環出現裂隙，排列輕度不規則，髓核出現皺縮或變小。8個月造模組椎間盤髓核完全纖維化，纖維環板塊層狀結構消失、玻璃樣變。赫永強等[10]采用透射電鏡觀察動物模型退變性頸椎間盤髓核超微結構的變化，可見造模2個月后開始出現退變軟骨樣細胞，細胞核固縮，細胞漿濃縮，線粒體腫脹，嵴消失，可見“髓鞘樣”小體。

本實驗參考文獻報道的方法，將彭寶淦與余家闊兩者的方法結合起來進行造模[5，6]，對術后4周及8周新西蘭兔進行拍片檢查，并參照余氏法評分對頸椎X線片進行評分及統計分析，模型組與正常對照組比較(P>0.05)，結果表明術后4周新西蘭兔頸椎退變不明顯；術后8周模型組與正常對照組比較，2組差異有統計學意義(P<0.05)，表明新西蘭兔頸椎發生明顯退變，與人體頸椎病椎間盤退變的病理改變相符。

3.2 頸康片方藥分析

根據中醫學理論，頸椎病屬于中醫學“痹證”范疇，神經根型頸椎病主要病機是肝腎虧虛、風寒入侵、氣血經絡失調，治療原則為扶正祛邪。頸康片具有補益肝腎、活血化瘀、溫經除痹等作用，由續斷、葛根、桂枝、川芎、白芍、甘草、雞血藤、威靈仙、制馬錢子、羌活、桑枝、天麻等組成，其中續斷補益肝腎、行血脈、續筋骨；川芎活血行氣、祛風止痛；川芎 “上行頭目，下行血海”，長于通行血脈，行氣活血止痛”。雞血藤行血補血、舒筋活絡；威靈仙祛風濕、通經絡、止痹痛；桂枝祛風寒濕、溫經通絡、辛溫發散，透達營衛，善于外行肌腠，去除風寒。《石室秘錄》曰：“手之麻木，乃氣虛風濕中之，必須用手經之藥引手中，而去風去濕之藥始能有效……然必得桂枝，始能入于手經也。”白芍養血斂陰、柔肝止痛，同時桂枝與白芍相合，一治衛強、一治營弱，合則調和營衛，相須為用；羌活祛風勝濕、散寒止痛，配伍桑枝祛風通絡、利關節、止痹痛，尤其適宜于上肢痹痛；天麻祛風濕、止痹痛，用于風濕痹痛及肢體麻木等證；葛根發表解肌、善治項背強痛，又可作為頸項部疼痛的引經藥；葛根有良好的發表解肌作用，為解肌之代表藥，常用于外感六淫之邪侵襲肌表引起的項背拘急之證；馬錢子通絡散結、消腫定痛，常用于風濕痹痛或拘攣麻木等癥。《醫學衷中參西錄》認為，本藥“開通經絡，透達關節之力，遠勝它藥”。

3.3 頸康片對退變頸椎間盤髓核超微結構的影響

頸椎病好發于中老年人，當椎間盤發生退變時，其形態學結構必然會發生一些變化。本實驗研究肉眼觀察可見，正常對照組椎間盤中央矢狀面剖開后髓核呈水凝膠狀突出；而生理鹽水組、頸康片組及頸復康組均見髓核變薄、含水量均有不同程度減少，呈軟黏稠膠狀，反光性減弱，其中生理鹽水組外觀改變最明顯，由此可見其退變最嚴重。在給藥4周后，通過電鏡觀察，頸康片組、頸復康組及生理鹽水組等3組均有不同程度退變的表現，其中生理鹽水組髓核退變程度最重，部分細胞退變、大部分細胞已壞死，膠原纖維明顯退變；而用藥2組髓核退變相對較輕，其中頸康片組髓核退變程度最輕，說明頸康片能夠減輕新西蘭兔頸椎間盤髓核組織軟骨細胞及其膠原纖維的退變程度。Hashizume[11]的研究表明，椎間盤退變形態學首先產生的變化是部分軟骨板從鄰近椎體的分離。纖維環與軟骨板是椎間盤的兩條營養途徑,當纖維環與軟骨板的變性勢必破壞了椎間盤內外物質的交換,促進了椎間盤退變，因此我們推測頸康片可能也是通過減輕纖維環與軟骨板的變性，從而減輕椎間盤退變。

《黃帝內經》認為，“丈夫……五八，腎氣衰……七八，肝氣衰。”肝主筋，腎主骨，人到中年肝腎漸虧，筋骨容易發生退化。椎間盤屬于“筋”的范疇，通過補益肝腎能夠強筋壯骨，所以頸康片能夠起到減輕頸椎間盤退變程度，改善神經根型頸椎病的癥狀。但從現代醫學角度來看，頸康片通過什么途徑發揮減輕頸椎間盤退變的作用，頸椎間盤退變程度減輕與癥狀的相關性等問題尚需今后進一步的研究。

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