基于“肝腎同源”探討DN大鼠肝中TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF在中藥治療前后的變化?

李光超，車念聰,耿建國，趙 暉，王志強，郭新新，白 辰

(1．首都醫科大學中醫藥學院,北京 100069； 2．北京市平谷區中醫醫院,北京 101200)

“肝腎同源”是中醫的經典理論之一，是指肝腎的結構和功能雖有差異但其起源相同,生理病理密切相關,可采用“腎肝同治”的治療法則[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropahy, DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，其主要的病理變化是腎小球硬化和腎間質纖維化[2]。研究顯示，TGF-β/Smad通路的激活是該病發生發展的重要環節，激活的TGF-β/Smad通路可以增加細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)中各種成分的表達，加速ECM進行性積聚，從而導致腎小球硬化[3]。α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin, a-SMA)被認為是肌成纖維細胞(myofibroblast,MyoF)的標志蛋白，肌成纖維細胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是細胞外基質的主要來源，而細胞外基質沉積增多是DN的主要病理特征[4]。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一種潛在的促有絲分裂的細胞因子，主要分布于增生的毛細血管內皮細胞、成纖維細胞和增生的腎小球細胞中。PDGF的過度表達可以促進系膜細胞增生和細胞外基質沉積，進而引起腎纖維化[5]。與此同時，在發生肝損傷時，上述指標也可以發生相應改變?；诖?，本實驗在中醫“肝腎同源”理論的指導下，通過觀察中藥方劑加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF治療前后表達的影響，探討其對DN大鼠肝臟的保護作用，從而為臨床糖尿病腎病“肝腎同治”提供實驗依據。

1 材料

SD雄性大鼠60只，體質量 160～180 g，鼠齡2～3月，購自首都醫科大學實驗動物科學部(動物合格證號SCXK(京) 2006-0009)；加味消渴康[6](為首都醫科大學耿建國教授治療糖尿病腎病的經驗方，由生黃芪、山萸肉、生薏苡仁、水蛭、葛根、丹參、決明子組成)購自北京祥威藥業公司；氯沙坦購自杭州默沙東制藥有限公司(生產批號100438)。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)美國Sigma公司；大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF ELISA試劑盒上海藍基生物科技有限公司；全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；電熱恒溫培養箱(DH4000A，天津泰斯特)。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組

本實驗采用單側腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型：將造模大鼠適應性飼養1周后，行右側腎臟切除術。術后2周，禁食12 h，按50 mg / kg劑量進行單次腹腔內注射鏈脲佐菌素。72 h后尾靜脈采血，用sure-step血糖儀測定大鼠血糖，用尿糖試紙測大鼠隨意尿糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性>+++，確定DN造模成功[7]。將造模成功的大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d-1)、加味消渴康小劑量組(13.125 g/kg·d-1)、加味消渴康中劑量組(26. 25 g/kg·d-1)、加味消渴康大劑量組(52. 5 g/kg·d-1)，另取10只大鼠作為正常對照組，每日1次，連續灌胃12周，正常組和模型組每日灌服2 ml蒸餾水。

2.2 標本采集和觀察指標檢測

各組大鼠于第12周末進行肝臟取材，每只取肝組織150～200 mg，以肝組織質量：生理鹽水量比例為1∶7。在冰浴中制備勻漿后4 ℃ 3000 r/min離心20 min，取上清液0.1 ml放入4 ℃冰箱備用。取出大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF Elisa試劑盒，室溫25～30 ℃放置30 min。取出酶標板，按照標準品次序分別加入50 μL的標準品溶液于空白微孔中?？瞻孜⒖字屑尤?0 μL的樣品，空白對照加入50 μL的蒸餾水。在各孔中加入100 μL的酶標記物溶液(不含空白對照孔)。將酶標板用封口膠密封后，37 ℃孵育反應1 h(在孵育箱中保持穩定的溫度與濕度)。充分清洗酶標板5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)。酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B各50 μL后，37 ℃避光反應10～15 min。各孔加入50 μL終止液終止反應。

2.3 統計學方法

3 結果

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝中TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組大鼠的TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)；其中中藥大、中劑量組與中藥小劑量組比較，Smad-4含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。

表1 各組大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4、a-SMA和PDGF比較

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01;與中藥小劑量組比較：#P<0.05,##P<0.01

4 討論

研究顯示，糖尿病腎病大鼠可以存在早期肝纖維化[8]。究其原因，西醫認為可能與持續的高血糖導致糖原在肝臟蓄積、發生微血管病變以及人體內分泌紊亂等進而波及肝臟有關。中醫認為，肝腎在生理上關系密切，病理上相互影響，即“肝腎同源”。故當腎臟發生損害時,肝臟的生理功能也會受到影響，發生肝損傷。

中醫認為，肝屬木，主疏泄、藏血，主筋華爪，開竅于目，具有升發、喜條達、惡抑郁、體陰而用陽的特性。腎屬水，主藏精、納氣，主生長發育和生殖，主骨生髓，開竅于耳，為人體的先天之本。在生理上，肝腎為子母關系，其氣相通，肝木得到腎水的滋養才能得以維持正常的生理功能。同時，腎藏精、肝藏血、 “精血同源”，肝中之血與腎中之精可以相互化生、相互充養。本實驗的研究對象為DN大鼠，而糖尿病腎病的中醫基本病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛以脾腎虧虛為主，標實則指痰濁、水濕、瘀血、毒邪等。由于該病發展是一個慢性過程，故病久必侵襲腎絡，導致腎絡瘀滯，即“久病入絡”。而中醫認為肝腎之氣互通、精血互化，故腎臟的損傷必然會導致肝的藏血和疏泄等功能受損，最終致使肝之血行不暢而發生肝絡瘀阻。

從實驗結果可以看出，模型大鼠肝組織TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表達與正常組比較均有一定程度的升高。研究發現，TGFβ1/Smad通路的激活可以促進肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)合成膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外基質,促進金屬蛋白酶組織抑制物的分泌,下調降解蛋白酶的合成而減少ECM的降解,進而使ECM沉積增多[9]。而a-SMA為HSC的細胞骨架表型，若肝臟中出現a-SMA陽性細胞，則提示HSC向肌成纖維細胞轉化，故α-SMA可作為HSC激活的一個標志[10]。PDGF則是一種強有力的促有絲分裂原，它不僅可以促進HSC的活化、分裂、增殖、遷移，且與TGF-β具有協同促纖維化作用[11]。由此看來，上述指標都與HSC的激活有著直接或間接的聯系。而激活的HSC可以通過增加ECM生成并降低ECM的降解，最終致使細胞外基質增多。同時，ECM在肝臟的過度聚集勢必會影響肝臟正常的血行，導致其血流不暢，而這也恰與中醫的“瘀血”病機甚為相似。因此，筆者推斷該過程可能是導致肝絡瘀阻的發生機制之一。在用中藥進行干預后，DN大鼠肝中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表達均有不同程度的降低趨勢，說明該方對DN大鼠肝損傷具有正向的調節作用。即在治療腎臟的同時，大鼠肝損傷也得到了一定的修復，此結果也與中醫的“肝腎同源”理論相符，并為其提供了一定的實驗依據。由此可知，在糖尿病腎病大鼠中，肝腎既可“同病”亦可“同治”，其既有理論推斷又有實驗依據。

本研究顯示，在糖尿病腎病發生時，肝臟中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF也發生了不同程度的改變，說明糖尿病腎病大鼠存在肝損傷。這就提示在臨床上在治療糖尿病腎病的同時，也需要保護肝臟，而對于肝損傷病理形態學的觀察及其他指標的檢測則有待進一步的研究。

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