前列消癥湯對前列腺癌PC-3細胞PI3K/Akt信號通路表達的影響?

宋豎旗，張亞強，薄 海

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，在歐美其發病率高達4.4%～14.2%，已成為第一位危害男性健康的腫瘤[1]。在我國，該病發病率呈逐年上升趨勢。

前列消癥湯是中國中醫科學院廣安門醫院劉猷枋教授臨床用于治療激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer，AIPC)的經驗有效方。前期臨床研究發現[2，3]，該方能明顯提高晚期前列腺癌患者生活質量，抑制PSA的過快增長，延長患者生存期，但其具體分子機制不明。本研究圍繞PI3K/Akt信號通路，采用血清藥理學方法探討含藥血清對PI3K/Akt信號通路中的重要分子PTEN、Akt、mTOR、NF-κB表達的影響，揭示中藥復方治療前列腺癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 人激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞株(簡稱PC-3細胞)購自中國醫學科學院協和醫科大學細胞庫，在我院中心實驗室長期凍存。

1.1.2 實驗藥物與試劑 F12/DMEM 1：培養基、胎牛血清(FBS)，美國Hyclone公司；胰蛋白酶，吉諾生物制品公司； RNA柱式抽提試劑盒，上海生工生物工程公司；RT-PCR試劑盒，上海東洋紡生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

CO2細胞培養箱，美國Shell Lab公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備廠；F039300A型Sunrise酶標儀，瑞士TECAN公司；高壓蒸汽滅菌器，日本HIRAYAMA 公司；臺式干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；RT-PCR儀，美國應用生物系統公司；凝膠成像系統，德國Leica公司；JY99-IIIB型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；5415R型高速離心機，德國Eppendorf公司；Lambdal P40紫外可見光分光光度儀，美國pe公司；Mini-ROTEAN3電泳系統與Mini Trans-Blot轉移系統，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 前列消癥湯水煎劑制備 前列消癥湯組方：黃芪15 g，生薏苡仁30 g，莪術9 g，土貝母9 g，豬苓15 g，白花蛇舌草20 g，黃精10 g。成年雄性Wistar大鼠20只，體質量250～300 g，采用隨機數字表法分為4組，每組5只。人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比率為人(70. 0 kg)∶大鼠(200 g)=1∶0. 018換算大鼠的等效劑量，分為低劑量組(大鼠與人等效劑量)、中劑量組(10倍于低劑量組)、高劑量組(20倍于低劑量2組)，計算各實驗組每只大鼠每天劑量，再計算5只大鼠7 d的劑量。將各組5只大鼠7 d劑量的中藥復方制備成水煎劑220 ml， 用于每組5只，每只大鼠每次3 ml，每天2 次灌胃共7 d。水煎劑制備過程：將上述劑量的3組藥方的中藥分別置煎煮容器內，加入相當藥材5倍量的冷水浸泡1 h，煮沸30 min過濾。藥渣再加3倍量的水，繼續煎煮20 min過濾。合并2次濾液，于水浴上濃縮成220 ml。水煎劑于開始灌胃的前1 d制備完成，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 含藥血清制備 將大鼠按隨機數字表法分為4組，每組5只。分別用3組中藥的水煎劑、生理鹽水灌胃，每次3 ml，每天2 次共7 d，末次給藥2次，間隔1 h。最后1次灌胃后于60～90 min 時間段內，10%水合氯醛注射液按3.5 ml/kg 劑量腹腔注射，大鼠麻醉后下腔靜脈取血，置于無抗凝管內。室溫下靜置30 min，待凝血堅固、血清析出。3000 r/min，離心20 min后，吸出上清即為含藥血清或空白血清。同組血清混合，用0.22 μm 的微孔膜過濾除菌、分裝，置于-20 ℃保存備用。

1.3.3 細胞培養 前列腺癌細胞株PC-3培養于含10%胎牛血清F12/DMEM1∶1培養基中，置于溫度為37 ℃氣體環境為5% CO2、濕度為飽和濕度的培養箱中培養。每2～3 d換液1次，5～6 d消化(0.25%胰蛋白酶液)、傳代。

1.3.4 細胞凍存 ①生長于對數期的細胞長滿培養瓶約90%以上時，加入消化液制成單細胞懸液；②細胞懸液離心后去除上清，加入預先配制好的凍存液重懸細胞；③將懸浮于凍存液的細胞按照每管約1.5 ml分裝于凍存管中，根據細胞生長狀態可1瓶凍1管；④先將凍存管置于4 ℃約40 min，接著置于-20 ℃約30～60 min、置于-80 ℃超低溫冰箱中放置過夜，最后置于液氮罐中長期保存。

1.3.5 細胞復蘇 ①將水浴鍋預熱至37 ℃；②從液氮罐中取出細胞，迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化；③酒精消毒凍存管的外壁，吸出細胞懸液注入離心管并加入10倍的培養液，混勻后離心去上清；④加入培養液重懸成單細胞懸液后，接種于培養瓶中繼續培養，第2天換液1次。

1.3.6 Western blot 免疫印跡測定蛋白表達 采用Western blot 免疫印跡法，以mTOR、p-AKT等蛋白表達為參照，與β-actin蛋白表達量的比值作為組織內蛋白的相對表達水平。具體步驟如下：①灌膠與上樣：配制15%分離膠加水封膠。分離膠凝固后配制4%的濃縮膠插入樣品梳，待到濃縮膠凝固后取出樣品梳。加入50 μg蛋白的上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。上樣前將樣品于沸水中煮5 min，使蛋白變性冷卻至室溫，加足量的電泳液后上樣；②電泳：先用80 V電壓電泳30 min，待樣品走出加樣孔后，將電壓調至100 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，停止電泳并拆開膠板；③轉膜操作：按膠大小切6張Whatman 3 mm 濾紙及1張PVDF膜，在預冷的1×轉膜Buffer中，浸泡凝膠30 min，浸泡PVDF膜、濾紙、海綿20 min，以1×轉膜Buffer注滿電轉膜槽，接通電泳儀，以60 V電壓轉移2 h。轉完后將膜用1×麗春紅染液染5 min，水沖洗后可見膜上的蛋白條帶；④免疫反應：將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。將c-fos等蛋白抗體以1×TBST稀釋至適當濃度(1∶1000稀釋)，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，4 ℃冰箱中孵育過夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min。同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸(約1∶1000)，室溫下孵育1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min，進行化學發光反應；⑤化學發光、顯影、定影：將膜發光底物工作液A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1 min，將膜移至X光片夾中曝光X片。曝光結束后放入顯影液中顯影并定影，自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干；⑥凝膠圖像分析：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3.7 RT-PCR法測定基因表達 ①細胞制備：用含10%胎牛血清的F12/DMEM1∶1培養液培養的PC-3細胞， 長至瓶底的80%～90%時棄去培養液，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，1500 rpm離心5 min，棄上清液收集細胞。用含10%胎牛血清的培養液將細胞制成單細胞懸液。將細胞懸液濃度調整至2×105ml，接種至六孔板中，37 ℃培養過夜，細胞貼壁，生長率達80%～90%，將培養液分別更換為含10%胎牛血清的培養液、大鼠空白血清及低、中、高劑量大鼠含藥血清培養液3 ml，培養24 h；②按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計測A260、A280，定量并檢測其純度，提取總RNA進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取的總RNA用Quick Master RT試劑盒反轉錄為cDNA。RT-PCR反應體系：2×RT-PCR Quick Master Mix 25ul，引物各10 pmol，RNA樣品0.1～2 μg，Mg2+2.5 μl，上游引物 10 pmol，下游引物 10 pmol，加DEPC水至50 μl。各β-actin(內參基因)、PTEN、RELA、mTOR等引物均由Primer Premier 5.0設計軟件設計，上海生工公司合成(引物序列見表1)。反應條件：90 ℃預變性30 min，90 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1min，共40個循環；72 ℃后延伸7 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。實驗中同步進行內對照β-actin的定量檢測，分別制備目的基因和內參基因β-actin的標準曲線。結果分析使用雙標準曲線法進行相對定量，以mTOR、PTEN、RELA(NF-κB)基因分別與β-actin拷貝數之比為目的基因的相對表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 含藥血清對PTEN、p-Akt、mTOR及NF-κB p65蛋白表達影響

表1 各基因引物序列

表2、圖1顯示，前列消癥湯大鼠含藥血清各劑量組培養前列腺癌PC-3細胞株24 h后，各細胞組的p-Akt蛋白水平、mTOR蛋白水平及NF-κB p65蛋白水平呈明顯下降趨勢，而PTEN蛋白水平呈現升高趨勢。前列消癥湯含藥血清中、高劑量組PTEN蛋白表達量明顯高于胎牛血清組(對照組)，差異有統計學意義(P<0.05)；前列消癥湯含藥血清中、高劑量組p-Akt和NF-κB p65蛋白表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；經含藥血清處理后，mTOR蛋白表達水平隨藥物劑量的升高呈現下降趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 含藥血清對PC-3細胞PI3K/Akt信號通路蛋白表達影響

注：與對照組比較：*P< 0.05

圖1 含藥血清對PI3K/Akt信號通路主要分子蛋白表達影響

2.2 含藥血清培養對mTOR、PTEN、RelA(NF-κB)基因表達的影響

表3、圖2顯示，用含10%血清的培養液培養前列腺癌PC-3細胞24 h后，前列消癥湯含藥血清高劑量組mTOR、RelA(NF-κB)基因表達被抑制，與胎牛血清組、空白血清組比較差異有統計學意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，mTOR基因表達差異無統計學意義(P>0.05)。前列消癥湯含藥血清高劑量組PTEN基因的表達增強，與胎牛血清組、空白血清組比較差異有統計學意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，PTEN基因表達差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 含藥血清對mTOR、PTEN和NF-κB/RelA基因表達影響

注：與胎牛血清組比較：*P< 0.05

圖2 含藥血清對PC-3細胞PI3K/AKT通路中mTOR、PTEN和NF-κB/RelA基因表達影響注：1.大鼠含藥血清高劑量組；2.胎牛血清組；3. 大鼠空白血清組

3 討論

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidy-linositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑之一。研究表明，PI3K/Akt信號通路對激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer，AIPC)的發生發展及轉歸中起重要作用。AIPC細胞表達大量活化的PI3K和Akt，活化的Akt能調節腫瘤細胞的增殖、凋亡、代謝、細胞周期以及腫瘤血管生成，促進AIPC的發生、發展[4～6]。PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromo-some ten) 是1個抑癌基因，能特異地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3’位脫磷酸，實現PI3K/AKT信號通路的負性調節[7]。PTEN丟失或功能失常是前列腺癌發生最常見的病因之一，而PTEN的失活必然導致PI3K/AKT通路活化。Wang等采用Cre-Loxp系統以去除PTEN的表達，構建的小鼠前列腺癌模型表明，由PTEN丟失引發的小鼠前列腺癌與人體前列腺癌發生有著相似的過程，并且還會引起該腫瘤細胞的轉移與不依賴于雄激素的增殖[8]。Akt處于PI3K/Akt信號傳導通路的核心部位，在細胞的增殖、生存及凋亡和細胞惡變的產生中扮演重要角色。Akt的活化與腫瘤的發生發展密切相關，活化的Akt在介導細胞生長和增殖、細胞運動和侵襲、細胞凋亡和抵抗化療、放療方面有重要作用。多種生長因子、激素、細胞因子、PTEN的失活等均可刺激Akt的活化。激活后的磷酸化Akt(p-Akt)蛋白再轉位到胞漿中或胞核內，通過對一系列底物的磷酸化，從而發揮其生物學功能。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是Akt最重要的底物之一。mTOR在哺乳動物中最重要的生物學功能是參與蛋白翻譯的調節，mTOR可整合細胞外生長因子、營養、能量等各種信號，通過RNA的轉錄尤其是蛋白質翻譯合成調控細胞的生長、增殖和分化。核轉錄因子kappa B(NF-κB)是1個轉錄因子蛋白家族，包括5個亞單位，即Rel (cRel)、p65 (RelA， NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)，最常見的NF-κB二聚體是p65與 p50組成的異二聚體。在靜息的細胞中，NF-κB 和NF-κB 的抑制單位IκB形成復合體，以無活性形式存在于胞漿中。當細胞受細胞外信號刺激后，IκB激酶復合體(IκB kinase，IKK)活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點。NF-κB與PI3K/Akt信號通路關系密切，它是Akt的作用靶基因之一。PKB/Akt可直接磷酸化IKKa，使IκB激酶(IKK)激活，調節NF-κB活性。PKB/Akt對于IKK介導的IκB降解和NF-κB激活是必需的。PKB/Akt是NF-κB依賴的基因轉錄的重要調節因素，對刺激前列腺癌細胞的生長有重要作用[9]。由此可見，PI3K/Akt信號通路對AIPC的發生發展起重要作用，PTEN功能失常激活PI3K/AKt信號通路，Akt與它的底物或靶基因促進了前列腺癌細胞增殖和抗細胞凋亡。

前列消癥湯(莪術、土貝母、豬苓、白花蛇舌草、生薏苡仁、炙黃芪、黃精組成)是由中國中醫科學院廣安門醫院著名中西醫結合泌尿外科專家劉猷枋教授治療激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的經驗方。劉猷枋教授在臨床診治過程中，觀察到晚期前列腺癌病機，多屬本虛標實，本虛指正氣不足、氣血虧虛，標實指濕熱、瘀毒[10]。正氣不足，邪氣蔓延，癌瘤破壞人體陰陽平衡，耗損氣血津液；多數患者經過藥物或手術去勢后腎精虧虛、氣血失和而出現潮熱、汗出等一系列癥狀。前列消癥湯就是在這個理論基礎上以利濕解毒、益氣養陰為治法組方而成，治療上應以扶正祛邪并用。方中生薏苡仁健脾滲濕為君藥；黃精、黃芪補氣養陰，配白花蛇舌草清熱解毒為臣藥；伍以莪術、土貝母、豬苓解毒散結、祛瘀止痛，共為佐使，諸藥合用共達利濕解毒、益氣養陰之功，體現了中醫扶正祛邪的原則。臨床累積治療AIPC患者100多例，發現該方能改善患者排尿困難、疼痛、食欲減低等癥狀，提高患者生活質量，延長患者生存期[2，3]。實驗研究發現，前列消癥湯能抑制人前列腺癌雄激素不敏感細胞株PC-3的增殖，誘導PC-3細胞的凋亡[11]。既然，PI3K/Akt信號通路對AIPC的發生發展起重要作用，前列消癥湯治療AIPC有效，且能抑制PC-3細胞的增殖。那么前列消癥湯能否調控PI3K/Akt信號通路而發揮治療作用？

為驗證上述推論，本研究采用血清藥理學方法，選取人PC-3細胞作為研究對象，制備前列消癥湯大鼠含藥血清、胎牛血清及含藥血清培養PC-3細胞，用Western Blot和RT-PCR法檢測含藥血清對PI3K/Akt通路中關鍵分子PTEN、Akt、mTOR、NF-κB表達的影響。Western Blot結果，前列消癥湯含藥血清各劑量組培養前列腺癌PC-3細胞株24 h后，各細胞組的p-Akt蛋白水平、mTOR蛋白水平及NF-κB p65蛋白水平呈明顯下降趨勢，而PTEN蛋白水平呈升高趨勢。與胎牛血清組(對照組)比較差異有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，含藥血清高劑量組效果更明顯。RT-PCR結果，前列消癥湯含藥血清高劑量組mTOR、RelA(NF-κB)基因表達被抑制，與胎牛血清組、空白血清組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，mTOR基因表達無統計學意義(P>0.05)。前列消癥湯含藥血清高劑量組PTEN基因的表達增強，與胎牛血清組、空白血清組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。由此可推論，前列消癥湯含藥血清能下調PI3K/Akt信號通路中Akt、mTOR和NF-κB表達，上調PTEN表達，這可能是中藥復方治療前列腺癌的分子機制之一。

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