愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-8和白細胞介素-18及炎細胞的影響?

謝文英，尚立芝△,張良芝,常學輝,胡文豪

(1．河南中醫學院，鄭州 450008; 2．河南省中醫院，鄭州 450008)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonarydisease,COPD)是常見的以氣道不完全可逆性阻塞為特征的慢性炎癥性疾病，由多種炎癥細胞及炎癥介質參與所致。其患病率隨年齡的增長而增加，是中國人群的主要致死病因之一[1]。COPD 主要臨床表現為咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，屬于中醫“咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇。本課題組自擬愛羅咳喘寧方，經多年臨床和前期動物實驗顯示，愛羅咳喘寧能顯著提高COPD患者和動物模型的肺功能，改善肺組織結構，但其作用機制不明[2～7]。本研究制備脂多糖(LPS) 加煙霧誘導COPD大鼠模型，觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠BALF 和血漿中參與炎癥反應的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素-8 (interleukin-1，IL-8 ) 和IL-18及炎細胞的影響，探討愛羅咳喘寧對COPD的作用機制。

1 材料

1.1 藥物與動物

愛羅咳喘寧方藥物組成:炙麻黃6 g,苦杏仁10 g,茯苓15 g,半夏10 g,葶藶子10 g,蒼術10 g,干姜6 g,麥芽20 g,白術12 g,山藥15 g,黨參15 g,芫花6 g等,以上藥物由河南中醫學院第一附屬醫院制劑室制成口服液,真空包裝,每支100 ml,含生藥100 g。6月齡雄性清潔級SD大鼠50只，體質量300±20 g，由河南省實驗動物中心提供(HNLA-2010-111)。

1.2 試劑與儀器

檢測大鼠TNF-α(H052)、IL-8(H008)和IL-18(H015) ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。自制動物熏箱(50 cm×50 cm×40 cm)、18號靜脈套管針(馬來西亞制造)、脂多糖(LPS，Sigma 公司)、紅旗渠牌香煙(烤煙型,焦油含量14 mg/支,尼古丁含量1.1 mg/支，河南安陽卷煙廠)。FA/JA電子天平(上海精密科學儀器有限公司)、TGL-16GA低溫高速離心機(上海安亭儀器廠)、VIS-7220型分光光度儀(北京第二光學儀器廠)、U-CMAD3型OLYMPUS顯微鏡(日本Olympus公司)、FAME16/30F全自動酶標議(瑞士哈美頓公司)等。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備

大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組(5，10，20 mL·kg-1·d-1)，每組10只。參照文獻[8,9]制備脂多糖(LPS) 煙霧誘導COPD大鼠模型。采用氣管注LPS加熏香煙方法：在第1天和第14天用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL注射器注入溶于生理鹽水的LPS200 μL(1 mg/mL)，然后將大鼠固定板直立旋轉，使LPS能夠均勻分布于兩肺。第2～28天(第14天除外)將大鼠置入熏箱內熏香煙煙霧40 min/次，每天2次(每次8支煙)，每周休息1 d；正常組第1天、第14天經氣管注入200 μL生理鹽水，其余無特殊處理。

2.2 給藥方案

模型制備成功后，參考文獻[10]正常組、模型組灌胃給予蒸餾水(10 mL·kg-1·d-1)，各治療組大鼠給予愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組分別灌胃混懸液(5、10、20 mL·kg-1·d-1，每毫升含愛羅咳喘寧口服液生藥0.75 g，連續7 d。

2.3 取材、標本制作與檢測

[11,12]和試劑盒說明書進行操作，ELISA法用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中大鼠血漿和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18濃度。

2.3.1 血漿TNF-α、IL-8和 IL-18 第7天給藥結束后，10%水合氯醛(0. 3 ml/100 g) 腹腔麻醉，剖腹抽取腹主動脈血，離心取血清放入-20℃冰箱內待測。

2.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的制備、炎細胞計數及分類 采血后斷頭處死大鼠，開胸暴露氣管和肺門，結扎右主支氣管。用套管針穿刺至左肺，以生理鹽水2 ml×3次行肺泡灌洗，回收率約80%，BALF存入硅塑管內靜置1 h。原液行細胞計數后，取1 mlBALF以2000 r/min離心5 min，取上清液置入EP管，保存于-20 ℃ 冰箱中待檢。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠BALF中炎細胞計數和分類比較

表1顯示，與正常組比較，模型組BALF中炎細胞總數和中性粒細胞數均顯著增高(均P< 0.01)。與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組BALF中炎細胞計數、中性粒細胞和巨噬細胞數顯著減少(P<0.05或P<0.01)。

3.2 愛羅咳喘寧對COPD大鼠血漿TNF-α、IL-8和IL-18 含量的影響

表2顯示，與正常對照組比較，模型組血漿TNF-α、IL-8和IL-18含量均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，愛羅咳喘寧口服液中劑量組TNF-α、IL-8和IL-18含量均顯著降低(均P<0.05)。

3.3 愛羅咳喘寧對COPD大鼠 BALF中TNF-α、IL-8和IL-18含量的影響

表3顯示，模型組 BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18都顯著高于正常組(均P<0.05)；與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組中TNF-α、IL-8和IL-18都顯著降低(均P<0.05)。

表1 各組COPD大鼠BALF中炎癥細胞計數和分類比較

注：與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；N-中性粒細胞，M-巨噬細胞

表2 愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠血漿IL-8、TNF-α含量的影響

注：與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01(下表同)

表3 愛羅咳喘寧各組COPD大鼠 BALF 中 IL-8 和 TNF-α 含量的影響

3.4 COPD模型組大鼠血漿和BALF 中TNF-α、IL-8和IL-18含量的相關性

應用非參數Spearman等級相關分析, 對TNF-α與IL-8含量的相關性進行分析, 結果顯示，在模型組中血漿TNF-α與IL-8呈正相關(rs=0.631,P=0.010)， BALF 中TNF-α與IL-8含量亦呈正相關(rs=0.783,P=0.000)。

4 討論

COPD的發病機制目前不清。研究表明，吸入有害物質引起氣道與肺的持續炎癥是COPD發病的關鍵。在COPD患者的氣道、肺實質和肺血管中均存在著巨噬細胞、嗜酸細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞增加，導致肺實質破壞，引起氣道狹窄。本研究結果顯示，模型組BALF中炎細胞總數和中性粒細胞數均顯著高于正常組(均P<0.01)，與文獻報道相近[13]，提示中性粒細胞的支氣管肺組織浸潤起重要作用。與模型組比較，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組BALF中炎細胞計數、中性粒細胞和巨噬細胞數顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)，提示愛羅咳喘寧通過抑制中性粒細胞和巨噬細胞數增加起抗炎作用。

COPD氣道與肺實質的持續炎癥涉及炎癥細胞及其釋放的炎癥介質。煙霧中的粉塵、細菌等進入氣道，刺激呼吸道上皮細胞產生炎性介質，TNF-α升高是COPD病情加重的一個重要指標，它可使IL-8轉錄因子NF-kB激活。香煙煙霧中的顆粒物質被巨噬細胞吞噬后，促進TNF-α、IL-8和IL-18的釋放[14]。IL-8起炎癥促進作用，并刺激中性粒細胞黏附于血管內皮，滲出并釋放中性粒細胞酶如蛋白酶、彈性酶等溶解細胞外基質，進而炎細胞浸潤，誘發炎癥反應和肺組織損傷[15]。

COPD的臨床表現屬于中醫“咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇，中醫認為其病因病機為六淫之邪侵襲入體，衛表受邪，肺失肅降，痰濁滋生，或他邪犯肺，或他臟腑累及于肺。本病其標在肺，其本在脾、腎。愛羅咳喘寧為自擬方藥，由炙麻黃、苦杏仁、云苓、蒼術、半夏、葶藶子、干姜、麥芽、白術、山藥、黨參、芫花、赤芍等藥物組成。方中炙麻黃辛散而微兼苦降之性，可使肺氣宣暢，以復肺司肅降、平喘之要藥，配伍杏仁祛痰止咳平喘，兩者同為君藥；臣以半夏燥濕化痰，葶藶子瀉肺降氣、祛痰平喘；干姜溫肺化飲，茯苓健脾化痰，芫花瀉水逐飲、祛痰止咳；佐以黨參健脾益肺，白術健脾益氣，山藥補脾、養肺、固腎、益精，蒼術燥濕健脾，麥芽健脾和胃，赤芍活血祛瘀，全方可起健脾祛痰、止咳平喘之效[4，5]。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組血漿和BALF中TNF-α、IL-8和IL-18水平均顯著增高，提示TNF-α、IL-8和IL-18共同參與 COPD 炎癥反應。與模型組比較，愛羅咳喘寧中劑量組大鼠血漿和BALF 中 IL-8、IL-18與TNF-α水平顯著低于模型組(均P<0.05)，提示愛羅咳喘寧可減低血漿和 BALF 中 TNF-α、IL-8、IL-18 水平，具有抑制 TNF-α、IL-8和IL-18合成與釋放，從而發揮其抗炎作用，可能是愛羅咳喘寧口服液治療COPD的作用機制之一。

參考文獻：

[1] 鐘南山.慢性阻塞性肺疾病在中國[J].中國實用內科雜志, 2011, 31 (5 ):321-322.

[2] 謝文英,景曉平.愛羅咳喘口服液治療支氣管哮喘42例[J].中國中醫藥信息雜志, 2005,12(2):82-83.

[3] 謝文英,常學輝,張良芝. 愛羅咳喘寧湯治療咳嗽變異性哮喘30例[J].中醫研究, 2007,20(5):35-37.

[4] 謝文英,常學輝,張良芝. 愛羅咳喘寧口服液對支氣管哮喘患者白細胞介素2及白細胞介素13的影響[J].中醫雜志,2007,48(7):614-615.

[5] 謝文英,常學輝,張良芝. 愛蘿咳喘寧口服液治療急性支氣管哮喘50例療效觀察[J].新中醫,2007,39(2):48-49.

[6] 謝文英,常學輝,張良芝. 愛羅咳喘寧方對支氣管哮喘患者IL-4、IL-5影響的臨床研究[J].新中醫,2008,40(7):40-41.

[7] 謝文英,張良芝,劉霖,等. 愛羅咳喘寧口服液對慢性支氣管炎大鼠白細胞介素-13 和腫瘤壞死因子-α含量的影響[J].中國新藥雜志,2012,21 (5 ):551-554.

[8] Mahadeva R, Shapiro S D. Chronic obstructive pulmonary disease:experimental animal models of pulmonary emphysema[J].Thorax,2002, 57: 908-914.

[9] 宋小蓮,王昌惠,白沖.脂多糖結合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較[J]. 第二軍醫大學學報, 2010,31(3):246-249.

[10] 宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預的影響[J].中華內科雜志, 2000, 39: 556-557.

[11] 王付,尚立芝,苗小玲,等. 四逆散加味對肝纖維化大鼠肝功能、肝纖維化指標及病理變化的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2012,18(5):177-180.

[12] 尚立芝,王付,苗小玲,等.四逆散加味抗大鼠肝纖維化作用機制[J].中國實驗方劑學雜志, 2012,18(18 ):194-197.

[13] Angshu B,Terence A R Seemungal,Raymond J Sapsford,et al.Relation of sputum inflammatory markers to symptoms and lung function changes in COPD exacerbations[J]. Thorax,2000,55:11-120.

[14] Wedzicha,J A.Mechanisms of exacerbations[J].Novartis Found Symp,2001,234:84-103.

[15] CrulT, SpruitMA, eta.lMarkers of inflammation and disuse in vastus lateralis of chronic obstructive pulmonary disease patients[J].European journal of clinical investigation, 2007, 11(37): 897-904.