老年慢性阻塞性肺疾病穩定期患者下呼吸道細菌定植與細胞免疫功能缺陷的關系研究

陳 謹，何耀紅，呼 瑋，朱瑞霞，劉淑梅，張 萍，崔建英

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可以預防和治療的常見疾病，其特征是持續存在的氣流受限，氣流受限呈進行性發展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎性反應有關[1]。國外部分研究表明老年COPD患者在穩定期存在免疫功能低下，容易引起下呼吸道細菌定植(low airway bacterial colonization，LABC)，是促進氣道炎性反應并導致肺功能進行性下降的重要原因[2]。本研究擬通過對老年COPD穩定期患者的下呼吸道標本做細菌培養并定量分析，測定痰及血中白介素8(IL-8)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)和痰免疫因子(CD4+、CD8+和CD4+/CD8+)水平來探索老年穩定期COPD患者LABC與細胞免疫功能缺陷的關系，從而指導疾病的臨床治療工作。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2011年1月—2012年12月在首都醫科大學附屬復興醫院呼吸科慢病管理人群中確診的COPD患者220例，從中篩查出年齡≥65歲的患者106例，按研究標準選取60例患者，同時在體檢中心招募同年齡段健康志愿者30例。入選標準：(1)老年COPD患者，年齡≥65歲；(2)COPD診斷明確，符合中華醫學會呼吸分會慢性阻塞性肺疾病診斷指南[3]，即吸入支氣管擴張劑后1 s用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，可逆實驗陰性，COPD的嚴重程度分級按照肺功能分級；(3)COPD穩定期：即既往6周無急性加重癥狀或罹患普通感冒及其他呼吸道感染性疾病；近4周未使用口服或靜脈抗生素；既往1年急性加重發作至少1次；試驗前72～96 h內停用H1-受體拮抗劑、β-受體阻斷劑(可能提高反應性)、含咖啡因及可可堿的物質(如咖啡)，72 h內停用腎上腺皮質激素類藥物及抗生素，48 h內停用茶堿類，12 h內停用β-受體興奮劑、抗膽堿能抑制劑，8 h內停用色苷酸鈉等藥物。排除標準：(1)既往有哮喘、支氣管擴張、支氣管腫瘤及其他明確肺部疾病的患者；(2)全身糖皮質激素治療劑量>20 mg/d；(3)既往確診患有免疫系統疾病；(4)罹患其他感染性疾病者。(5)健康志愿者需近兩個月內未服用不明成分中藥、酒精及免疫調節藥物。本研究經首都醫科大學附屬復興醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意，并簽署知情同意書參加此項研究。

1.2 標本收集

1.2.1 痰液收集

1.2.1.1 痰標本收集及細菌定量 入選患者在醫生指導下漱口，深咳痰入無菌痰盒，無痰者則行3%氯化鈉溶液霧化10 min后導痰，留取深部痰，并測定誘導痰前后的肺功能。合格痰液(<2 h，鏡檢如多核白細胞>25個/低倍視野，鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野，或兩者比例<1∶2.5為合格痰液)立即送檢。立即用無菌氯化鈉溶液沖洗痰液3次，用英國OXOID公司生產的Sputolysin使痰液均質化后，再進行細菌定量培養。Sputolysin與痰液比例為1∶1，此1∶1懸液視為原液(定量計算時加以校正)。預先準備好4個無菌試管，每管含氯化鈉溶液4.5 ml。吸取混勻懸液0.5 ml加于第Ⅰ稀釋管內(10-1)，再從第Ⅰ稀釋管內吸取混勻懸液0.5 ml加于第Ⅱ稀釋管內(10-2)，依次稀釋，使第Ⅰ～Ⅳ試管內痰液稀釋液分別為10-1～10-4。每次取痰液量0.01 ml接種于VX/苯乙醇血平皿和中國藍瓊脂培養皿及巧克力培養皿中。細菌生長后，按常規做細菌菌種鑒定。本試驗誘導痰是在監測肺功能的情況下進行的，安全、可靠。

1.2.1.2 痰液制備 將第1步留取的剩余的痰標本(≥8 ml)用微量稱稱重，加4倍重量的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)，用振蕩器震蕩旋轉15 min，并予吸管反復渦狀抽吸，直至痰液與DTT均勻混合為止。再將混懸液放入離心機以1 500 r/s離心10 min，上清液分裝，其中4 ml-80 ℃保存，備用。

1.2.2 血及血清標本的收集 抽取患者血液5 ml，用離心機以1 500×g離心10 min，血清分裝，-80 ℃保存，備用。

1.3 方法 (1)采用美國RayBiotech試劑盒，使用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定痰液及血液中IL-8因子的水平。(2)高敏C反應蛋白(hs-CRP)的測定采用乳膠凝集法分別測定COPD穩定期患者和對照組血清hs-CRP。(3)痰T細胞亞群的測定應用美國BD型流式細胞儀，以淋巴細胞群設門，以相應的同型對照IgG染色細胞為陰性對照，每份樣品檢測1 000個細胞，用SimulSET型軟件分析結果。具體步驟如下：①試驗前將所有試劑及標本放置室溫溶解；②分別加入CD4+和CD8+抗體(Ab)和同型對照各20 μl，雙色標記單抗試劑，混勻后室溫避光30 min。③加紅細胞溶血劑2 ml，室溫避光10 min后1 000 r/min離心10 min，棄去上清。④加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml，洗滌1次，棄上清，再1 000 r/min離心10 min，棄去上清。再次加PBS 2 ml，1 000 r/min離心10 min，棄上清。⑤加500 μl PBS重懸細胞，上機檢測分析。

1.4 肺功能的測定 采用德國Jaceger公司Master PET設備測定各項指標。通氣測定FEV1、FVC及FEV1/ FVC。肺功能分級方法：輕度:FEV1≥80%；中度：50%≤FEV1<80%；重度：30%≤FEV1<50%；極重度：FEV1<30%。

2 結果

2.1 一般資料 觀察組因痰液不合格剔除6例，距測定時間4周內服用抗生素剔除4例，最終納入觀察組50例，對照組30例。兩組患者吸煙量、住院≥1次人數、FEV1、FEV1/FVC相比差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 痰標本細菌培養結果 老年COPD穩定期患者痰培養陽性者共32例(64.0%)，其中4例合并有2種致病菌，故共檢出致病菌36株。主要是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、副流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌及真菌，分別占27.8%、16.7%、13.9%、11.1%、8.3%、8.3%、5.6%、5.6%、2.7%，見表2。定量分析結果顯示30例(60.0%)COPD穩定期患者痰菌落計數大于106cfu/ml，確定為細菌定植，存在的致病菌分別為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和真菌。

對照組中無致病菌檢出，只有1例檢出草綠色鏈球菌，其為口腔正常菌群，考慮由痰液污染引起。

2.3 不同肺功能分級的患者LABC情況 入選的老年COPD穩定期患者肺功能損傷全部在中度以上，其中有4例存在兩種致病菌，占11.1%。肺功能分級中度者20例，細菌定植陽性率為50.0%(10/20)；重度者23例，細菌定植陽性率為65.2%(15/23)；極重度者7例，其中細菌定植陽性5例。

表1 兩組臨床資料比較

注：△為χ2值，余檢驗統計量值為t值，-為Fisher確切概率法；FEV1=1 s用力呼氣容積，FVC=用力肺活量

表2 老年COPD穩定期患者LABC情況

注：細菌定植數量均已進行對數處理；COPD=慢性阻塞性肺疾病，LABC=下呼吸道細菌定植

2.4 不同定植情況患者細胞炎性因子水平比較 定植組與無定植組相比痰IL-8、血IL-8及血hs-CRP差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of inflammatory cytokine between LABC and without LABC groups

組別例數痰IL-8(ng/L)血IL-8(ng/L)血hs-CRP(mg/L)定植組3040873±286096349±42981215±813無定植組2024261±85523666±1191 650±397 t值270353213P值001000004

注：IL-8=白介素8，hs-CRP=高敏C反應蛋白

2.5 老年COPD穩定期患者LABC痰細胞免疫因子水平 與對照組相比，定植組CD4+下降(q=11.64)，CD8+升高(q=7.65)，CD4+/CD8+比值倒置(q=10.60)，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，無定植組CD4+/CD8+(q=4.90)差異有統計學意義(P<0.05)。與定植組相比，無定植組CD4+(q=8.82)、CD8+(q=4.22)、CD4+/CD8+(q=4.57)差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

Table4 Comparison of cell immune factor among control group,LABC group and without LABC group

組別例數CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對照組303840±4922432±876189±090無定植組203637±8262896±745129±027定植組302506±5973644±930073±031F值451160318P值001002001

3 討論

本研究結果證實，部分老年穩定期COPD患者存在LABC，這與國內外的研究結果相同[4-5]。正常人下呼吸道是無菌的，因為機體存在完善的防御系統，但對于吸煙且存在氣道阻塞的COPD患者，由于肺部防御體系的損害導致下呼吸道病原體清除障礙[6]，使COPD患者在穩定期時下呼吸道仍攜帶有細菌，即存在細菌定植。本研究也證實COPD患者與對照組在細菌定植方面有較大的不同。

本研究結果顯示下呼吸道致病菌的檢出率為64.0%，檢出率較高，同時細菌定植量也較大，痰標本菌落計數大于106cfu/ml的占60.0%。因為本研究對象為老年患者，因此細菌定植率略高于其他國內外研究結果[7-8]。致病菌以流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌為主，分別占27.8%和16.7%，其次可見卡他莫拉菌、副流感嗜血桿菌分別占13.9%、11.1%，這也與國內外的報道相似[4，9]。除上述常見致病菌外，還可見一些院內感染致病菌如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及真菌等。其中4例患者可檢出1種以上的致病菌，占11.1%，而這些患者都有1次以上住院經歷。本組患者肺功能以中、重度阻塞性通氣功能為主，肺功能損傷越重的患者，細菌定植率越高。

COPD穩定期患者中，存在細菌定植的患者痰IL-8和血IL-8水平高于無定植的患者，hs-CRP水平亦高于無定植的患者。有研究表明，中重度COPD穩定期患者可因為下呼吸道細菌定植而導致菌落數量增加，從而促進炎性反應，使氣道發生一系列病理變化，包括炎性因子的升高使COPD急性加重趨于頻繁[10]，本研究中也可以得出相似的結論。IL-8是最重要的細胞因子，是迄今發現的最強的中性粒細胞趨化因子，是中性粒細胞活化的標志。大量的中性粒細胞長期聚集，分泌多種細胞因子作用于氣道局部，可以加重并延長炎性反應，因此痰中的IL-8水平明顯高于血中的IL-8水平。同時IL-8的趨化作用和誘導中性粒細胞脫顆粒作用有助于對病原微生物的殺傷效應，而細菌及其代謝產物又會使呼吸道上皮細胞產生細胞因子，并因正反饋作用使炎性效應放大，進而導致全身炎性反應。COPD患者系統炎性反應的發生機制目前尚不清楚，目前有兩種觀點，第一種觀點認為COPD患者肺內的炎性反應及其代償事件導致炎性反應的“溢出”[11]，因為COPD患者體循環中也存在有類似氣道炎性反應改變的因素，故有學者認為是氣道炎性反應的“外溢”引起了系統炎性反應[12]。而第二種觀點認為，COPD的肺部表現只是全身系統性炎性反應所累及的一個臟器。總之，既可以是系統性炎性反應起源于肺部炎性反應的“溢出”，也可能是多器官疾病造成系統性炎性反應的肺部表現[13]，具體的原因尚需進一步研究。CRP是肝臟合成的一種急性時相反應蛋白，是反映機體感染的敏感指標，尤其是hs-CRP。肺部感染引起局部組織炎性反應損傷，其炎性反應及組織損傷物質大量進入肺循環，產生免疫反應，刺激各種細胞因子，通過相應的細胞因子介導在肝臟合成全身的CRP物質，導致機體反應性的CRP升高。但當感染控制和組織修復后CRP可迅速恢復，與疾病變化同步[14]。同時引起hs-CRP升高的原因還有高血壓、冠心病、代謝綜合征等疾病[15]，本次研究對象為COPD穩定期患者，定植組與無定植組的患者hs-CRP水平有差異，氣道炎性反應是否通過外周血hs-CRP反映出來還有待進一步探索。

COPD穩定期患者定植組患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與健康人相比有差異，CD4+減少，CD8+升高，CD4+/CD8+甚至出現倒置情況。機體維持正常的免疫功能狀態依賴于各種免疫細胞，特別是各類T細胞亞群之間的相互協作和制約，產生適度的免疫應答。越來越多的證據表明，COPD進展惡化的原因除病原微生物的侵襲外，還與機體免疫功能缺陷有關。COPD患者的免疫功能低下和紊亂表現為CD4+降低，CD8+升高，CD4+/CD8+比值降低，甚至倒置，本研究的結果與其一致。Tsoumakidou等[16]研究表明，CD4+/CD8+比值是反映機體免疫紊亂敏感指標，其比值的降低是機體免疫下降的重要標志，下降程度與疾病嚴重程度和預后不良密切相關。提示老年COPD穩定期患者下呼吸道細菌存在定植時機體免疫功能降低，T淋巴細胞擴增減少，影響抗原提呈，同時機體免疫功能缺陷時，機體的防御機制破壞，也容易導致COPD穩定期患者的LABC[17-18]。

對痰液標本的檢測是研究COPD的重要方法之一。在以往的試驗方法中，多數學者通過患者自行咳痰；用不同水平的氯化鈉溶液行痰誘導留取標本；用吸痰管吸取深部痰液及纖支鏡肺泡灌洗等方法獲取痰液。前兩種方法雖簡單，但患者配合度差，痰液合格率低；后兩種方法對于患者來說，痛苦較大，對氣道黏膜也有一定的損傷，不易進行。因此在本次研究中進行痰誘導，而且所有進行痰誘導的患者均在嚴密監測肺功能的情況下進行，未出現不良反應，并提高了痰標本的合格率，因此是安全、可行的。

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關于慢性阻塞性肺疾病與細菌定植關系的假說如下：(1)惡性循環假說: 吸煙者的黏膜纖毛清除能力受損和局部免疫抑制使得細菌病原體較易在下呼吸道定植，這些定植的病原體及其產物又可通過增多氣道黏液分泌、破壞纖毛運動能力和損傷氣道內皮等進一步引起氣道黏膜纖毛清除能力的損傷，從而使得細菌病原體在下呼吸道的長期定植更加容易。這種細菌及其產物對黏膜上皮細胞的潛在損傷作用在大氣道可有利于細菌的殘留，在小氣道則有助于形成細支氣管炎逐漸引起支氣管阻塞。(2)新致病菌株學說：慢性阻塞性肺疾病的急性加重期可以檢出新致病菌株，而檢出的這些新致病菌菌株被認為與急性加重的發生密切相關，表明慢性阻塞性肺疾病的急性加重是由新致病菌株的感染造成。(3)細菌定量假說：慢性阻塞性肺疾病急性加重或其他癥狀的出現可能與呼吸道內細菌濃度的閾值有關。一旦超過閾值，就會出現氣道炎癥反應，從而產生臨床癥狀，且不同患者的閾值不同，這與患者的個體差異、病程、基礎疾病、免疫狀態等多方面的修正因素，以及細菌類型、寒冷和空氣污染對閾值的影響有關。