核基質蛋白22定量分析及尿液細胞學檢查評估膀胱癌復發的價值研究

彭曉暉，梁培育，歐善際，祖雄兵

膀胱癌是目前泌尿生殖系統最常見的腫瘤之一，發病率較高。流行病學調查研究發現，膀胱癌的發病率占整個泌尿系統腫瘤的48.3%[1]。淺表性膀胱癌是來自泌尿系統上皮的惡性腫瘤，能達到70%的發病率，且淺表性膀胱癌復發的幾率較高。有研究證實，淺表性膀胱癌的復發率可達到60%～85%[2-3]。臨床建議對腫瘤患者進行長時間的隨訪以監測腫瘤的復發及病情的進展，因此膀胱癌患者通常在手術后前2年，每3個月或4個月行膀胱鏡檢查以及尿液細胞學檢查，其中膀胱鏡檢查被認為是診斷的金標準。在后期也建議對患者進行定期隨訪以監測腫瘤的復發情況[4-6]。但由于膀胱鏡在檢查中易對人體造成侵襲性損傷，且檢查費用相對較高，因此臨床中出現了很多新技術用于對膀胱癌的復發監測，包括：流式細胞術、定量熒光圖像分析,核基質蛋白22(NMP22)定量分析法等，目前針對這些方法在膀胱癌復發檢測中的準確性研究現已廣泛開展[7-11]。NMP22試驗可以定量分析核基質蛋白的含量，NMP22即為核有絲分裂器蛋白，其中核有絲分裂器由泌尿上皮細胞凋亡后產生[12-14]。NMP22主要存在于尿液中，膀胱癌患者尿液中的NMP22水平顯著增高。有研究表明，膀胱癌患者尿液中NMP22的水平可達到正常人群的20～80倍[13]。NMP22在膀胱癌診斷中的靈敏度可以達到尿液細胞學檢查的靈敏度[15]。鑒于此，本研究通過對膀胱移行細胞癌復發的不同階段和時期進行尿液NMP22定量分析以及尿液細胞學檢查，以比較兩種方法評估膀胱癌復發的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008—2012年在海南醫學院附屬醫院住院的淺表性膀胱癌患者144例，其中男125例，女19例；年齡26～86歲，平均61.8歲。淺表性膀胱癌的診斷標準[16]為：非肌層浸潤性膀胱癌或淺表性膀胱癌占初發膀胱癌的70%，其中Ta期占70%、T1期占20%、Tis期占10%。排除合并尿路感染、泌尿系結石及其他惡性腫瘤的患者。本研究經醫院倫理委員會批準，且患者均簽署書面知情同意書。

1.2 試驗方法 患者均在3 d內連續每天提供3份用于尿液細胞學檢查的尿液樣本以及1份用于NMP22定量分析的尿液樣本。

1.2.1 尿液細胞學檢查 將患者尿液離心取沉淀物制片，干燥后行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，普通光鏡觀察并進行細胞學診斷，發現膀胱腫瘤細胞(腫瘤細胞具有核大、畸形、深染等特點)，為尿液細胞學檢查陽性。

1.2.2 NMP22定量分析 本研究使用Matritech公司的NMP22試劑盒(Matritech Inc,330 Nevada St,Newton,MA)進行檢測，NMP22定量分析按Matritech公司的試劑盒說明書進行操作。于膀胱鏡檢查前收集患者單次新鮮自排尿50～100 ml，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法(美國Matritech公司生產)，按照說明書操作，經全自動酶標儀在490 nm處比色，數據經儀器所配置計算機處理系統處理，繪制標準曲線，計算樣本NMP22水平。NMP22試劑盒將膀胱癌定性的截點設定為10 U /ml,測試結果> 10 U /ml作為陽性結果。

1.2.3 膀胱鏡檢查 患者均經膀胱鏡檢查常規觀察腫瘤部位、形態，并做腫瘤活檢，其病理結果作為金標準。膀胱鏡檢查過程中，任何可疑的腫塊以及病灶均取病理活檢，檢查結果按照TNM系統[17]進行分期〔原位癌(CIS)、Ta期(非浸潤性乳頭狀癌)、T1期(腫瘤侵及上皮下結締組織)、T2期(腫瘤侵犯肌層)〕以及WHO系統[18]進行分級〔Ⅰ級(尿路上皮癌，分化良好)、Ⅱ級(尿路上皮癌，中度分化)、Ⅲ級(尿路上皮癌，分化不良)〕。在膀胱鏡檢查中視野內為正常組織或者組織病理學檢查結果為非惡性組織的定義為陰性；對于膀胱鏡檢查未發現腫塊，但患者尿液細胞學檢查以及NMP22定量分析有陽性發現的患者需要進一步行膀胱內隨機組織病理學活檢[19]以排除泌尿系腫瘤的可能。根據膀胱癌復發進展等方面的風險因素，將所有患者病理學結果劃分為3個風險層次：低度風險(單個病灶為TaG1期，且病灶直徑<3 cm)，中度風險〔排除低度及高度風險的患者,包括腫瘤多發、Ta～T1期、G1～G2期(低級別尿路上皮癌)、病灶直徑>3 cm〕，高度風險〔多個病灶T1G2期,Tis期(CIS),T1G3期,TaG3期〕對于高度風險的患者應每4周復查1次，直至治療后9個月。明確具有上尿路病灶以及膀胱病灶的患者定義為陽性。

1.4 統計學方法 使用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤特征 144例患者中,52例(36.1%)診斷為復發性膀胱移行細胞癌，其中48例通過首次膀胱鏡檢查直接診斷，4例在隨訪期間膀胱鏡檢查診斷。隨訪期間診斷的4例患者中1例為CIS伴尿液細胞學檢查為陽性，其余3例腫瘤較小且伴NMP22定量分析陽性(其中2例患者為T1G2期，1例為T1G3期)。52例膀胱癌復發患者中，Ⅰ級16例，Ⅱ級20例，Ⅲ級16例； Ta期18例，T1期22例，CIS 3例，T2期9例；風險分層：低度風險25例，中度風險19例，高度風險8例。

2.2 NMP22定量分析及尿液細胞學檢查對膀胱癌復發的診斷價值 52例膀胱癌復發患者中，41例NMP22定量分析結果為陽性，23例尿液細胞學檢查為陽性。NMP22定量分析診斷膀胱癌復發的靈敏度為78.8%(41/52)，特異度為69.6%(64/92)，陽性預測值為59.4%(41/69)，陰性預測值為85.3%(64/75)；尿液細胞學檢查診斷膀胱癌復發的靈敏度為44.2%(23/52)，特異度為83.7%(77/92)，陽性預測值為60.5%(23/38)，陰性預測值為72.6%(77/106，見表1)。兩種方法診斷膀胱癌復發的靈敏度和特異度比較，差異有統計學意義(χ2=6.58、5.40，P=0.01、0.02)；而兩種方法診斷膀胱癌復發的陽性預測值和陰性預測值比較，差異無統計學意義(χ2=3.13、0.50，P=0.08、0.48)。

2.3 兩種方法對腫瘤分期及分級的靈敏度分析 52例膀胱癌患者中按不同分期，NMP22定量分析CIS 2例，Ta期11例，T1期21例，T2期7例；尿液細胞學檢查CIS 3例，Ta期2例，T1期10例，T2期8例。按不同分級，NMP22定量分析I級11例，Ⅱ級17例，Ⅲ級13例；尿液細胞學檢查I級0例，Ⅱ級8例，Ⅲ級15例。按風險分層，NMP22定量分析低度風險17例、中度風險17例、高度風險7例；尿液細胞學檢查低度風險4例、中度風險10例、高度風險9例。NMP22定量分析與尿液細胞學檢查在不同分期、分級、風險分層中的靈敏度比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 NMP22定量分析及尿液細胞學檢查對膀胱癌復發的診斷價值

Table1 Value of voided urine cytology and NMP22 quantitative analysis in the diagnosis of recurrent bladder TCC

金標準陽性 陰性合計NMP22定性分析陽性412869陰性116475合計5292144尿液細胞學檢查陽性231538陰性2977106合計5292144

2.4 聯合兩種檢測方法對膀胱癌復發的診斷價值 NMP22定量分析聯合尿液細胞學檢查、NMP22定量分析聯合膀胱鏡檢查、尿液細胞學檢查聯合膀胱鏡檢查診斷膀胱癌復發的靈敏度分別為88.5%(46/52)、98.1%(51/52)及94.2%(49/52)。

3 討論

膀胱鏡檢查目前被認為是膀胱癌診斷的金標準，但其也存在侵襲性損傷以及相對昂貴的檢查費用等不足[20-21]。尿液細胞學檢查是針對尿液中尿路脫落上皮細胞的細胞形態學檢查，但對于體積較小的腫瘤以及組織分化較好的患者，因自然脫落的細胞較少，因而診斷具有一定難度。正因為如此，尿液細胞學檢查在低度風險組的腫瘤患者中靈敏度較低，僅為15%～30%[14]。目前在臨床膀胱癌檢測中也出現了很多基于尿液標記物的新檢測手段以替代尿液細胞學檢查，其中包括：BTA stat,BTA trak，NMP22，UroVysion等檢測[22-23]。NMP首先于1974年被發現,是一種非染色質結構,作為細胞核形態支撐組織構建DNA,同時NMP還參與DNA的復制和轉錄,以及RNA加工過程。NMP22是核蛋白質，其在染色體的調控、復制過程中以及細胞分離中意義重大。

目前大量研究和報道已證明NMP22檢測比尿液細胞學檢測具有更好的應用前景[24-25]。有研究認為，NMP22檢測在膀胱癌檢測中的靈敏度為70%～80%，而尿液細胞學檢查的靈敏度僅為10%～40%[9,26-28]，NMP22的敏感度為后者的2倍以上。本研究發現，NMP22定量分析診斷膀胱癌復發的靈敏度為78.8%，特異度為69.6%，陽性預測值為59.4%，陰性預測值為85.3%；尿液細胞學檢查診斷膀胱癌復發的靈敏度為44.2%，特異度為83.7%，陽性預測值為60.5%，陰性預測值為72.6%；兩種方法診斷膀胱癌復發的靈敏度和特異度有明顯差異。提示NMP22的定量分析診斷膀胱癌復發的靈敏度較高，但其特異度較尿液細胞學檢查低。本研究中尿液細胞學檢查的靈敏度較目前其他研究者報道的靈敏度較高，這可能與本研究在行尿液細胞學檢測時，使用3個血樣本進行反復檢測，從而提高了尿液細胞學檢測的靈敏度有關。

NMP22檢測方法也存在一定缺陷，如缺乏確切的定量分界點等[29-31]。Jamshidian等[24]研究建議將NMP22水平為10.1 U/ml作為患者的膀胱癌檢測分界點。本研究使用Matritech公司的NMP22試劑盒(Matritech Inc,330 Nevada St,Newton,MA)進行檢測，并將膀胱癌定性的截斷值設定為10 U /ml,測試結果>10 U /ml作為陽性結果。本研究表明,在不同分期和分級的淺表性膀胱癌復發患者中，NMP22定量分析在Ta期、T1期、I級、Ⅱ級診斷膀胱癌復發的靈敏度高于尿液細胞學檢查，但在Ⅲ級以及高度風險的患者中，兩種方法之間無明顯差異。Kumar等[25]研究發現NMP22在低度風險膀胱癌患者中的靈敏度能到達尿液細胞學檢查的8倍，但在中度風險以及高度風險患者中無此差異。提示檢測尿中NMP22可能對膀胱癌的早期診斷有一定價值。本研究還發現，NMP22定量分析聯合尿液細胞學檢查、NMP22定量分析聯合膀胱鏡檢查、尿液細胞學檢查聯合膀胱鏡檢查診斷膀胱癌復發的靈敏度分別為88.5% (46/52)、 98.1% (51/52)及94.2% (49/52)，優于單獨使用NMP22定量分析或者尿液細胞學檢查對膀胱癌復發的診斷價值，為今后進一步研究提供了參考依據。

綜上所述，本研究發現將NMP22定量分析作為一種監測標志物,可以早期、敏感地發現腫瘤的復發與進展，且無創傷，不僅可以有效減少有創的膀胱鏡檢查次數，減少患者的痛苦，還有利于患者進行早期治療與干預，值得臨床推廣應用。由于本次研究的陽性樣本數較少，以及研究手段的局限，可能會對研究結果造成一定的影響，提示今后還可增大樣本量，或者采用分子生物學研究方法對本次研究進行驗證。

表2 NMP22定量分析及尿液細胞學檢查在不同分期及分級膀胱癌復發中的靈敏度分析(%)

注：與NMP22定量分析比較，*P<0.05

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