不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對人腎小管上皮細胞凋亡的影響

吳麗丹,馮勝軍,卓華欽，張莞靈，劉華鋒

許多研究證實尿蛋白在慢性腎臟疾病的進展中發揮了非常重要的作用。尿蛋白的主要作用是能夠活化腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell,rTEC)，使其分泌各種生物活性因子，在腎間質中激活成纖維細胞和趨化炎性細胞，參與腎間質纖維化。而腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展到終末期的共同途徑。腎間質纖維化與細胞增殖、凋亡的動態平衡密切相關[1-2]。但是，尿蛋白的性質(清蛋白、轉鐵蛋白、IgG、40～100 kD血清蛋白等)和嚴重程度在腎小管間質病變進展中的作用仍有很大分歧。此外，不論是體外還是動物模型中，總是存在一些問題，如大多數研究僅使用一種或兩種蛋白，或者使用正常血清清蛋白而非患者的血清蛋白對腎小管細胞損傷進行研究。此外，不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白能否直接導致rTEC凋亡及其差異性，尚無肯定報道。因此，本實驗選取臨床上常見的人類不同腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節段性腎病綜合征)的完整尿蛋白刺激人腎小管來源的rTEC，分析其凋亡情況，旨在為尿蛋白對人腎小管-間質纖維化的機制提供重要依據，為延緩慢性腎衰竭的進展尋找治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cell,hrTECs)由上海第二醫科大學附屬瑞金醫院陳楠教授惠贈。相差顯微鏡下可見正常的hrTECs為多角形鵝卵石樣排列，胞體扁平，細胞緊密銜接，融合成單層。已經過鑒定，確認為近端hrTECs，保證了本課題以后實驗的真實性和可靠性。二氧化碳(CO2)培養箱(Heraeus，Germany)，倒置顯微鏡(MP-50型，Leica Germany)，熒光顯微鏡及成像系統(Leica German)。胎牛血清(Invitrogen)，DMEM/F12培養基(Gibco,U.S.A)，Hochest 33258(Sigma,U.S.A)。

1.2 細胞培養 從液氮罐中取出冷凍hrTECs，37～40 ℃水中快速復溶，加適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液(含0.03% L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，置于培養箱內培養，培養條件為37 ℃、5%CO2。0.125%胰蛋白酶(Trysin)-0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)消化傳代。

1.3 尿蛋白的提取與質量分析 選取廣東醫學院附屬醫院腎內科已經臨床確診的原發性腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節段性腎病綜合征)的尿蛋白，且無感染并發癥，尚未應用激素及任何免疫抑制劑，腎活檢病理類型分別為微小病變、膜性腎病和局灶-節段性腎病綜合征。收集入選患者清潔中、后段尿，冷凍離心，飽和硫酸銨沉淀尿蛋白。PEG20000濃縮。超濾滅菌。蛋白濃度定量。-70 ℃保存備用。挑取一小部分蛋白溶液行蛋白質量驗證。蛋白電泳：做該標本來源尿液的蛋白電泳，旨在排除尿蛋白在提取過程中是否發生成分變化；細菌內毒素試驗：旨在確保蛋白沒受細菌污染；蛋白溶液的肌酐水平：旨在看蛋白是否還混有尿液。

1.4 Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡 hrTECs培養于6孔板中，載玻片爬片，無血清細胞培養液孵育24 h，使細胞同步于靜止期，棄上清液，加含尿蛋白培養液，每種病理類型尿蛋白濃度分別為0、1、2、4、8 g/L，孵育細胞48 h；3∶1的甲醇∶冰醋酸液4 ℃固定5 min，5 mg/L的Hoechst 33258避光染色5 min。選用340 nm的激發光觀察：在熒光顯微鏡下，活細胞呈彌散均勻熒光，凋亡細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果見到3個或3個以上的DNA熒光碎片被認為是凋亡細胞。計算每孔5個高倍(×400)視野平均細胞總數、凋亡細胞數和細胞凋亡百分率。空白組設置為無尿蛋白的培養液刺激hrTECs。

2 結果

2.1 細胞形態和表面結構 相差顯微鏡下可見正常的hrTECs為多角形鵝卵石樣排列，胞體扁平，細胞緊密銜接，融合成單層(見圖1)。

圖1 正常DMEM/F12培養基培養的hrTECs(×200)

2.2 抽提尿蛋白的質量及分析結果 每種病理類型選擇3例患者，分別抽提出患者的尿蛋白，蛋白溶液的肌酐水平為0.381 μmol/L，均低于人體參考范圍的下限(參考范圍44～133 μmol/L)，鱟實驗確定細菌內毒素試驗檢測值為0.008 EU/ml，亦低于人體參考范圍的下限(0.1 EU/ml)。尿蛋白電泳示各病理類型腎病綜合征患者尿蛋白成分相同，主要為清蛋白、轉鐵蛋白、IgG。微小病變腎病綜合征清蛋白83.8%、轉鐵蛋白11.9%、IgG 3.4%；膜性腎病綜合征清蛋白56.4%、轉鐵蛋白34.6%、IgG 6.9%；局灶-節段性腎病綜合征清蛋白59.9%、轉鐵蛋白15.3%、IgG 13.8%(見圖2)。

圖2 不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白的電泳分析

Figure2 Electrophoretic analysis of urine proteins from patients with three types of nephrotic syndrome

2.3 腎病綜合征患者尿蛋白對細胞凋亡的影響 尿蛋白濃度1、2、4、8 g/L時，膜性腎病綜合征組較微小病變腎病綜合征組細胞凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；局灶-節段性腎病綜合征組較膜性腎病綜合征組和微小病變腎病綜合征組細胞凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。3組尿蛋白濃度1、2、4、8 g/L時較空白時，2、4、8 g/L時較1 g/L時，4、8 g/L時較2 g/L時，8 g/L時較4 g/L時細胞凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

3 討論

腎功能的進展主要取決于腎間質損傷的嚴重程度。研究表明，尿蛋白可作為獨立的致病因子，直接造成腎小管間質損害[3-4]。對多種人類和動物模型研究提示尿蛋白是參與損傷和加速腎功能惡化的重要因素[5]。其中，rTEC增殖凋亡參與了腎間質纖維化的發生，推測rTEC的過度凋亡可能是腎小管萎縮的原因，并參與了腎間質纖維化的發生機制。在多種腎臟疾病的動物模型(如單側輸尿管結扎模型、5/6腎切除模型、高血壓腎硬化模型、慢性環孢霉素腎病模型、嘌呤霉素氨基核苷慢性腎病模型等)[6-8]以及人體多種腎臟疾病病理標本中發現，間質纖維化越重的地方，rTEC凋亡數量越多，間質纖維化程度與細胞凋亡數量呈正相關[9]。但是，成分復雜的尿蛋白中哪種蛋白成分在疾病的發展過程中具有致病作用，迄今尚無定論。許多研究表明清蛋白導致腎小管間質損傷。該機制包括上皮細胞-成肌纖維細胞的轉分化，細胞因子以及炎性因子〔單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、轉化生長因子β(TGF-β)等〕的分泌、細胞外基質(ECM)的聚積、平滑肌蛋白SM22-α表達等[10-13]。不過這些研究使用了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白，或許無法真實模擬尿中清蛋白的作用。另外許多研究表明某些尿蛋白也許不是腎小管間質損傷的始動因素。Morais等[14]發現低分子量蛋白不會影響hrTECs的凋亡，而高分子量蛋白則影響hrTECs的凋亡。并且轉鐵蛋白也可以通過hrTECs上調C3的合成，而不是清蛋白[15]。因此，真實地分析腎病患者的尿蛋白成分、比例以及與腎間質纖維化的關系，有助于進一步了解腎間質纖維化發生發展的分子機制。

本實驗首先采集尿蛋白，并進行質量分析(尿蛋白內的細菌內毒素對細胞凋亡帶來毒性已經排除，肌酐檢測可以排除尿液成分殘留)，提供了實驗數據的可靠性；為了更加明確在腎間質損傷中尿蛋白的主要毒性成分，因此對尿蛋白的組分差異性進行分析，通過蛋白電泳提示不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白成分相同，主要為清蛋白(大部分)、轉鐵蛋白、IgG。其中，微小病變腎病綜合征清蛋白83.8%、轉鐵蛋白11.9%、IgG 3.4%；膜性腎病綜合征清蛋白56.4%、轉鐵蛋白34.6%、IgG 6.9%；局灶-節段性腎病綜合征清蛋白59.9%、轉鐵蛋白15.3%、IgG 13.8%。采用體外實驗，選取人近端hrTECs株，采用上述人類不同病理類型腎病綜合征患者的完整尿蛋白刺激hrTECs，發現同一病理來源的尿蛋白的濃度與hrTECs凋亡增加存在劑量依賴關系，即細胞凋亡數量愈多，由于該類蛋白組合源于患者自身的蛋白，尤其是其中的清蛋白占了大多數，導致hrTECs的凋亡或許與該類蛋白相關，也旁證了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白導致的腎小管間質損傷。此外，局灶-節段性腎病綜合征患者的尿蛋白作用最強，膜性腎病綜合征次之，微小病變腎病綜合征最弱，根據3類病理類型的尿蛋白的組成可以發現，IgG的組分含量由多至少分別為局灶-節段性腎病綜合征、膜性腎病綜合征、微小病變腎病綜合征。Bazzi等[16-17]研究證實局灶-節段性腎病綜合征患者尿IgG占總蛋白的比例與節段性腎小球硬化有相關性。由此，可以推測，尿中存在的IgG可能是尿蛋白對腎小管毒性作用的重要因素，尿IgG的排出可能是腎病進展的標志之一。由此，可能提示在尿蛋白引起的腎臟纖維化進展中，尿清蛋白可能不是最重要的毒性成分。尿蛋白其他成分如脂蛋白、轉鐵蛋白和補體與腎小管間質損害的關系有待下一步的有關研究證實。

表1 不同病理類型腎病綜合征細胞凋亡率比較Table 1 Comparison of apoptosis rate of hrTECs among different pathological types of nephrotic syndrome

注：與微小病變腎病綜合征組比較，*P<0.05；與膜性腎病綜合征組比較，△P<0.05；與尿蛋白濃度空白比較，▲P<0.05；與尿蛋白濃度1 g/L比較，☆P<0.05；與尿蛋白濃度2 g/L比較，★P<0.05；與尿蛋白濃度4 g/L比較，◇P<0.05

眾所周知，細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程,是機體清除非機體所需細胞、維持自身細胞穩定性的一種特殊的細胞死亡方式,也是清除異常增殖細胞的一種重要途徑。以上分析表明，hrTECs的異常凋亡與尿蛋白存在必然關系，尤其是尿中IgG成分的存在和含量的多少，與hrTECs的凋亡具有重要的因果關系和劑量關系，大量腎小管細胞凋亡，使腎小管局部環境破壞，這可能是觸發間質細胞過度增殖，并最終形成纖維化的重要因素。本研究結果可能為深入闡明腎間質纖維化提供重要的實驗依據，最終將為延緩慢性腎衰竭的進展尋找治療新途徑。

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