兔退變椎間盤纖維環及髓核組織中的PG、MMP-3、TIMP-2表達變化及意義

劉 林，駱文遠，張 超，宋玉鑫，舍 煒

(甘肅省人民醫院骨二科，蘭州 730000)

近年來研究發現，椎間盤基質的分解是椎間盤退變的一個主要特征，其中基質、膠原、蛋白多糖等是椎間盤的重要組成成分，并被椎間盤細胞產生的酶所降解。這些降解酶中最主要的是基質金屬蛋白酶(MMPs)。其作用可表現為以下兩個方面：翻譯后對蛋白水解酶活性進行調節；激活酶類，通過和基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)結合，進一步對MMPs進行調節[3]。但是，MMPs及TIMPs對椎間盤退變的影響尚不清楚。本實驗擬在建立兔椎間盤退變模型的基礎上，觀察退變椎間盤組織纖維環和髓核中蛋白多糖(PG)、MMP-3和TIMP-2的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6月齡普通級新西蘭大白兔42只(影像學檢查排除椎體先天性畸形和椎間盤病變)，體質量(2.5±0.5)kg，雌雄不限，分為實驗組和對照組，各21只。選擇直徑110 mm、長70 cm的PVC管，將實驗動物固定在PVC管中，實驗組將PVC管直立，對照組將PVC管平放。將動物在管中連續固定5 h/d，建立椎間盤退變模型。經X線檢查實驗動物脊柱發生退變，證實建模成功。分別于建模后4、8、12周各取7只動物的L4～5椎間盤組織。10%甲醛溶液固定24 h，經脫鈣、脫水處理后，行矢狀位取材，石蠟包埋后切片。

1.2 PG的檢測 用高碘酸-希夫(PAS)染色觀察椎間盤中纖維環和髓核中的PG。PAS染色后細胞外基質中的PG呈紫紅色[4]。隨機從每組7張組織切片中選取1張，在×100視野下對纖維環和髓核隨機選取5個不重復視野。采用Image-Pro Plus6.0軟件進行分析處理，將灰度值閾值調為 0～255，以灰度值間接反映PG的相對含量(灰度值越高表明PG含量越低)。

1.3 MMP-3、TIMP-2的檢測 采用免疫組化SP法。鼠抗兔MMP3單克隆抗體、鼠抗兔TIMP-2單克隆抗體購自艾美捷科技有限公司，免疫組化SP試劑盒購自邁新生物技術公司。取兩組椎間盤組織，石蠟4 μm切片后常規脫蠟至水化，3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，微波修復抗原3 min后自然冷卻，用正常羊血清工作液封閉10 min，加入一抗稀釋液37 ℃孵育3 h后PBS沖洗 3次，添加用生物素標記的二抗37 ℃孵育15 min后PBS沖洗3次，添加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min后PBS洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，PBS沖洗返藍，經梯度乙醇脫水干燥、透明中性樹膠封片。從每組7張組織切片中隨機選取1張，Olympus光學顯微鏡×400視野下對纖維環和髓核隨機選取5個不重復視野拍攝照片，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定每張照片的平均光密度值(MOD) 。

2 結 果

2.1 建模不同時間兩組椎間盤纖維環及髓核組織中PG的表達比較 髓核中染色呈紫紅色的物質減少，經4、8、12周實驗組和對照組相比較髓核的灰度值變化差異有統計學意義(P<0.05)，且實驗組、對照組內各造模時間段(4、8、12周)髓核的灰度值變化差異也有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 經PAS染色實驗組及對照組髓核和纖維環中PG 灰度值比較

a:P<0.05,與實驗組纖維環平均灰度值相比較;b:P>0.05;c:P<0.05，與對照組纖維環平均灰度值比較。

2.2 MMP-3和TIMP-2在椎間盤中的表達情況 MMP-3 、TIMP-2陽性為細胞質見棕色顆粒(圖1),在纖維環中(表2)，對照組中同一時間MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；隨著造模時間的延長實驗組各時間段TIMP-2較MMP-3的平均MOD值差異明顯(P<0.05)，其中在12周時平均MOD值差異有統計學意義(P<0.01)。在相同組別不同時間段比較，對照組中MMP-3的平均MOD值在8周時無明顯差異(P>0.05)，在12周時平均MOD值較8周時發生明顯變化(P<0.05)；TIMP-2的平均MOD值隨著造模時間的延長變化明顯，其中在8周時差異不明顯(P<0.05)，在12周時差異明顯(P<0.01)。實驗組中MMP-3隨著造模時間的延長MOD值逐漸增大(P<0.05)，而TIMP-2的平均MOD值在8周時相對4周無明顯差異(P>0.05)，在12周時平均MOD值明顯增大(P<0.05)。

A:TIMP-2蛋白；B:與MMP-3蛋白。

圖1 髓核組織中TIM-P2與MMP3的表達(SP×400)表2 MMP-3、TIMP-2在實驗組及對照組纖維環中 平均MOD值的變化比較

a：P<0.05，c:P<0.01，與實驗組MMP-3平均MOD值比較;b：P>0.05，與對照組MMP-3平均MOD值比較。

在髓核中對MMP-3、TIMP-2比較平均MOD值(表3)表明，在對照組及實驗組同一時間點MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比較差異有統計學意義(P<0.05)。在相同組別不同時間段進行比較結果表明隨著時間的延長，對照組MMP-3及TIMP-2的平均MOD值在8周時差異無統計學意義(P>0.05)，在12周時平均MOD值均增大明顯(P<0.05)；實驗組MMP-3及TIMP-2的平均MOD值差異有統計學意義(P<0.05)，且MMP-3在12周時平均MOD值增大差異明顯(P<0.01)。

表3 MMP-3、TIMP-2在實驗組及對照組髓核中平均 MOD值的變化比較

a：P<0.05，與實驗組MMP-3比較；b：P<0.05，與對照組MMP-3比較。

3 討 論

本研究考慮到手術中取出的人類椎間盤可能會破壞其完整性，故選擇用動物模型來觀察完整椎間盤纖維環和髓核退變中PG、MMP-3、TIMP-2的表達變化。通過本實驗發現，在椎間盤的退變過程中早期髓核中PG的變化明顯快于纖維環。且不論實驗組還是對照組髓核組織中PG均較纖維環組織中變化明顯。有研究表明，人類椎間盤退變早期改變表現為PG聚合體數量的減少以及髓核的脫水[6]，多種因素導致的椎間盤組織學中改變首先影響終板，其次是髓核，最后是纖維環[7]，本研究結果與以上研究結論相一致。

本研究發現，隨著造模時間的延長，對照組及實驗組同一時間點髓核中MMP-3的表達明顯高于TIMP-2。且隨著建模時間的延長實驗組中MMP-3和TIMP-2的表達均增加明顯。對照組同一時間點隨著造模時間的延長纖維環中MMP-3和TIMP-2的平均MOD值比較差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組隨著造模時間的延長各時間段TIMP-2較MMP-3的表達變化明顯。該結果提示在椎間盤退變的過程中MMP-3和TIMP-2在椎間盤的纖維環和髓核中表達不同，其中MMP-3主要在髓核中表達，而TIMP-2主要在纖維環中表達。這可能和其所起的作用不同有關。髓核內細胞在胚胎為脊索樣細胞，在健康成人主要以軟骨樣細胞為主，合成Ⅱ型膠原和PG。纖維環中為梭形的類成纖維細胞，主要合成Ⅰ型膠原。PG及核心蛋白的表達在髓核最高，由內向外逐漸減弱，在椎間盤退變過程中，PG逐漸被富含膠原組織的纖維組織所替代，最后導致髓核纖維化，水分隨之喪失。而MMP-3作為一種基質降解酶，其作用底物范圍廣，其主要作用底物是基質中PG和糖蛋白[8]。MMP-2作為一種明膠酶，和膠原酶共同在纖維環中降解膠原，而TIMP-2在纖維環中的高表達，可能和TIMP-2在組織中可以1∶1以非共價鍵形式與活化的MMP-2形成復合物，有效地抑制MMP-2的膠原分解活性及明膠活性有關[9]。

因此，對MMP-3、TIMP-2在椎間盤退變中所起作用的研究結合髓核PG的變化可能會對臨床診斷、基因治療和組織工程技術的應用有一定幫助。但是細胞因子作為一種復雜的網絡系統，還需要進一步深入研究其相互之間的作用機制。

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