應用高效液相色譜法測定纈沙坦氨氯地平片有關物質

彭熙琳，吳品江，周唯蘭，周芯宇，李元波

(1.四川大學華西藥學院，成都 610044；2.揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司，四川都江堰611830)

纈沙坦氨氯地平片為瑞士諾華公司(Novartis)產品，商品名：倍博特，規格為纈沙坦80 mg和氨氯地平5 mg，2007年在美國獲批準上市，2009年在中國獲批準進口上市，為抗高血壓藥。血管緊張素ⅡAT1受體拮抗劑(纈沙坦)和鈣離子拮抗劑(苯磺酸氨氯地平)是較好的聯合抗高血壓藥物的治療方案[1-4]。纈沙坦氨氯地平片臨床療效優于單方，而且安全性和耐受性較單方好[5]，擬開發的產品劑型、規格與原研市售品一致，有著較廣闊的市場前景。

目前該藥質量標準為纈沙坦氨氯地平片進口藥品注冊標準JX20080182(以下簡稱標準[7])，在對該藥品進行檢驗時，發現該標準中有關物質檢測規定有值得探討之處，采用標準中色譜條件檢測樣品，發現其纈沙坦出峰時間在18 min左右，而該色譜條件采集時間為25 min，因此可能導致25 min后的雜質峰無法檢出，或造成漏判。因此本文對纈沙坦氨氯地平片的有關物質進一步的研究，在試驗基礎上對檢查方法和標準規定提出建議。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DE54627713型高效液相色譜儀(美國安捷倫)；BP61型Sartorius電子分析天平(上海精科儀器廠)；氨氯地平雜質D(批號：F0I143,USP)；纈沙坦雜質B(批號：H0K089，USP)；纈沙坦雜質C(批號：H1J021，USP)，苯磺酸氨氯地平(批號：100374-200903，中國藥品生物制品檢定所)；纈沙坦(批號：100651-200902，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇和乙腈為色譜純；水為重蒸餾水，其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.8作為流動相A，甲醇作為流動相B，乙腈作為流動相C，按表1進行梯度洗脫，檢測波長為238 nm；柱溫40 ℃。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 溶液的配制 取本品細粉適量(相當于纈沙坦80 mg和氨氯地平5 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液，另取苯磺酸氨氯地平對照品、氨氯地平雜質D對照品、纈沙坦雜質B、纈沙坦雜質C以及纈沙坦對照品各適量，精密稱定，加流動相溶解并制成每1 mL約含苯磺酸氨氯地平70 μg、氨氯地平雜質D 20 μg、纈沙坦雜質B 10 μg、纈沙坦C 10 μg和纈沙坦800 μg的混合溶液作為系統適應性溶液。

1.2.3 波長的選擇 對供試品溶液采用DAD在200～400 nm全波長掃描，發現本品在238 nm波長處其雜質個數及雜質檢出量最大，同時各已知雜質在238 nm波長處有較大吸收，故選擇238 nm作為本品有關物質的檢測波長。

1.2.4 系統適用性試驗 精密量取空白溶劑、供試品溶液及對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

1.2.5 專屬性試驗 (1)對照試驗：取本品細粉適量，精密稱定，加流動相適量超聲溶解，放冷，加流動相相稀釋制成每1 mL含有1.6 mg纈沙坦和0.1 mg氨氯地平的溶液，搖勻，作為未破壞樣品溶液；另取苯磺酸氨氯地平原料適量、纈沙坦原料適量，同法試驗。(2)光照試驗：取本品細粉適量，置太陽光下照射10 h，取樣品適量，加流動相溶解稀釋定容，搖勻，取續濾液測定；另取苯磺酸氨氯地平原料適量，纈沙坦原料適量，空白輔料適量，同法試驗。(3)高溫試驗：取本品細粉適量，加流動相適量，于100 ℃水浴中放置4 h后，放冷，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取續濾液即得高溫破壞樣品溶液；另取苯磺酸氨氯地平原料適量，纈沙坦原料適量，空白輔料適量，同法試驗。(4)氧化試驗：取本品細粉適量，加入雙氧水(10%)10 mL，在60 ℃加熱30 min左右，冷卻后用流動相稀釋至刻度，搖勻，取續濾液即得氧化破壞樣品溶液；另取苯磺酸氨氯地平原料適量，纈沙坦原料適量，空白輔料適量，同法試驗。(5)堿破壞試驗：取本品細粉適量，精密稱定，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，于60 ℃加熱25 min后，并用1 mol/L鹽酸溶液5 mL中和后，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，取續濾液即得堿破壞樣品溶液；另取苯磺酸氨氯地平原料適量，纈沙坦原料適量，空白輔料適量，同法試驗。(6)酸破壞樣品：取本品細粉適量，精密稱定，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，于60 ℃加熱20 min后，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，用流動相稀釋至刻度，搖勻，取續濾液即得酸破壞樣品溶液；另取苯磺酸氨氯地平原料適量，纈沙坦原料適量，空白輔料適量，同法試驗。

A:未破壞；B:光照試驗圖；C:高溫試驗；D:氧化試驗；E:堿破壞試驗；F:酸破壞樣品。

圖1 降解試驗HPLC圖

1.2.6 檢測限和定量限測定 取纈沙坦對照品、苯磺酸氨氯地平對照品、氨氯地平雜質D對照品、纈沙坦雜質B對照品，纈沙坦雜質C對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成較低濃度的溶液，精密量取10 μL，分別注入液相色譜儀。

1.2.7 雜質的線性關系考察及校正因子計算 取氨氯地平雜質D、纈沙坦雜質B、纈沙坦雜質C的對照品適量，加流動相配制成一系列濃度的溶液，在有關物質測定條件下進樣測定，記錄峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸。氨氯地平雜質D校正因子計算方法：采用標準曲線法測定氨氯地平雜質D對氨氯地平的相對響應因子，即將兩回歸曲線方程斜率之比即為校正因子。同法計算纈沙坦雜質B和纈沙坦雜質C校正因子。

1.2.8 溶液穩定性和精密度試驗 取供試品溶液、自身對照溶液、氨氯地平雜質D對照品溶液、纈沙坦雜質B對照品溶液和纈沙坦雜質C對照品溶液，測定有關物質溶液穩定性和進樣精密度。

1.2.9 樣品測定 取三批樣品，精密稱定，研細，分別稱取相當于纈沙坦80 mg和氨氯地平5 m的粉末，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液；取系統適應性溶液作為已知雜質對照品溶液，取上述溶液進高效液相色譜儀分析，記錄色譜圖，采用加校正因子主成分自身對照法計算已知單個雜質，最大單個雜質以及總雜質。

2 結 果

2.1 系統適用性試驗 空白溶劑無干擾，系統適用性溶液各相鄰雜質峰與供試品主峰分離，符合規定。

2.2 專屬性試驗 結果表明，本品兩個主成分原料及制劑在各破壞條件下的降解產物峰均能與氨氯地平及纈沙坦的主峰實現良好的分離，且各已知雜質與未知雜質之間分離度均符合要求。

2.3 檢測限和定量限測定 分別記錄各儀器色譜圖，使其S/N約為3時的進樣量作為檢測限，使其S/N約為10時的進樣量作為定量限，結果見表2。

A：氨氯地平雜質D；b：氨氯地平；c：纈沙坦雜質B；d：纈沙坦；e：纈沙坦雜質C。

圖2 系統適應性溶液色譜圖表2 檢測限和定量限測定結果(ng)

2.4 雜質的線性關系考察及校正因子計算 纈沙坦回歸方程Y=27.671X+1.880 6，在0.10～27.56 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.999 9；氨氯地平回歸方程：Y=23.608X+1.977 2，在0.08～20.91 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.999 9；氨氯地平雜質D回歸方程：Y=11.697X+0.784 5，在0.13～32.77 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.999 9；纈沙坦雜質B回歸方程：Y=28.28X+0.854 4，在0.09～23.07 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.999 9；纈沙坦雜質C回歸方程：Y=20.804X+0.545 1在0.11～26.86 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.999 9。

氨氯地平雜質D校正因子為2.0；纈沙坦雜質B和纈沙坦雜質C校正因子為1.0。

表3 有關物質檢查結果

2.5 溶液穩定性和精密度試驗 結果顯示溶液在8 h內穩定，RSD為1.38%(n=6)；供試品溶液、自身對照溶液、氨氯地平雜質D對照品溶液、纈沙坦雜質B對照品溶液和纈沙坦雜質C對照品溶液進樣精密度良好，RSD分別為1.46%，0.69%，0.58%，0.78%，0.89%(n=6)。

2.6 樣品測定 對三批樣品進出測定，結果如表3所示。

3 討 論

纈沙坦氨氯地平片主要含有苯磺酸氨氯地平和纈沙坦兩種有效成分，有關物質含量高低與藥品質量和安全性相關，因此控制制劑有關物質含量十分必要，該制劑主要有關物質纈沙坦雜質B、纈沙坦雜質C和氨氯地平雜質D等的引入主要是原料和制劑工藝，建立一套纈沙坦氨氯地平片有關物質檢測方法控制纈沙坦氨氯地平片質量，至關重要。在標準中，主要對已知雜質纈沙坦雜質B和氨氯地平雜質D進行了檢測，方法采用外標法，計算各雜質含量，采用的操作方法較為復雜，準確性較低；而在文獻[6]中，主要對纈沙坦雜質B進行了檢測和控制，未對纈沙坦雜質C進行研究，有一定缺陷性。本文采用加校正因子主成分自身對照法來建立一套纈沙坦氨氯地平片有關物質檢測方法，能夠準確而有效的測定纈沙坦氨氯地平片中的有關物質，能夠控制該產品質量，與加校正因子外標法計算雜質含量的方法相比較，該法測定操作等相對簡單便捷，專屬性強，準確性高。

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