樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞抗前列腺癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)

匡幼林，鄧遠(yuǎn)忠，梁思敏，茍 欣

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016)

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤之一，近年來，我國前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢，前列腺根治性切除術(shù)和放療是治療早期前列腺癌的有效手段。但對于局部進(jìn)展期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，目前卻沒有令人滿意的治療方法[1]。眾多研究表明腫瘤患者的免疫功能低下，腫瘤細(xì)胞可通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別[2]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可以誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced cells,CIK)是一種經(jīng)多重細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，增殖能力強(qiáng)、高效殺滅腫瘤細(xì)胞的免疫活性細(xì)胞。研究表明，DC和CIK聯(lián)合使用，能提高腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞免疫能力，達(dá)到抗腫瘤免疫的作用。同時(shí)，DC-CIK對很多腫瘤細(xì)胞的殺傷活性較相同條件下單純CIK細(xì)胞明顯增強(qiáng)[3]。本研究通過探討DC-CIK體外作用于前列腺癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)，為前列腺癌免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)購自PeproTech公司，白細(xì)胞介素-12(IL-12)和IFN-γ ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；CD3單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD3抗體、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的CD8和CD56抗體均購自德國BD Pharmingen公司；CCK-8 購自日本同仁化學(xué)研究所；RPMI 1640和胎牛血清培養(yǎng)液購自Gibico公司；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所；人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3購自中國科學(xué)院。

1.2 DC和CIK的體外誘導(dǎo) 采集健康志愿者的外周血80 mL左右，用淋巴細(xì)胞分離液分離并收集單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度為6×106/mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。收獲未貼壁的細(xì)胞，取部分重懸于含有1 000 U/mL IFN-γ的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24 h后添加500 U/mL的rhIL-2和50 ng/mL的CD3單克隆抗體，每隔3 d半量換液1次，培養(yǎng)第7天，收獲CIK細(xì)胞；另取部分細(xì)胞培養(yǎng)于含有50 ng/mL CD3單克隆抗體的完全培養(yǎng)基，每隔3 d半量換液1次，培養(yǎng)第7天即為T細(xì)胞。將貼壁細(xì)胞用含有10 ng/mL的rhGM-CSF和10 ng/mL的rhIL-4完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液1次，培養(yǎng)第7天收獲DC細(xì)胞。

1.3 DC-CIK共培養(yǎng) 收獲培養(yǎng)第7天的DC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，按1∶10的比例和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，用含500 U/mL的rhIL-2完全培養(yǎng)基隔天半量換液1次，共培養(yǎng)7 d。

1.4 IL-12 和 IFN-γ的檢測 分別取培養(yǎng)第7天的DC組、DC-CIK組、DC-T組和CIK組培養(yǎng)上清液100 μL，按照IL-12和IFN-γ ELISA試劑盒的操作要求，分別檢測各組培養(yǎng)上清液中的IL-12和IFN-γ含量。

1.5 FCM檢測細(xì)胞表型 分別離心收集培養(yǎng)第7天的DC組、DC-CIK組、DC-T組和CIK組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3次后，分別添加FITC標(biāo)記的人CD3抗體及PE標(biāo)記的CD8、CD56抗體，4 ℃避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 細(xì)胞毒效應(yīng)檢測 收集PC3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/mL，并接種至96孔培養(yǎng)板中，作為檢測細(xì)胞毒效應(yīng)的靶細(xì)胞。分別取培養(yǎng)第7天的DC組、DC-CIK組、DC-T組和CIK組細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞按10∶1、20∶1、50∶1接種到靶細(xì)胞孔中進(jìn)行混合培養(yǎng)。24 h后，采用CCK-8法檢測各孔吸光度值，按公式計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。殺傷活性(%)=[(靶細(xì)胞對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/靶細(xì)胞對照組A值]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 IL-12 和 IFN-γ的檢測 用IL-12和IFN-γ ELISA試劑盒分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-12和IFN-γ的濃度，結(jié)果表明：DC-CIK組細(xì)胞分泌的IL-12、IFN-γ濃度分別為(105.14±2.16)、(726.28±21.35)pg/mL，較DC組、DC-T組和CIK組均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 細(xì)胞表型分析 FCM分析顯示：DC-CIK組、DC-T組和CIK組細(xì)胞均高表達(dá)CD3，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DC-CIK組CD3+/CD56+和CD3+/CD8+細(xì)胞數(shù)分別為(27.80±1.01)%、(60.90±1.28)%，較DC-T組和CIK組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 細(xì)胞毒效應(yīng)評價(jià) 以PC3細(xì)胞為靶細(xì)胞，DC組、DC-CIK組、DC-T組和CIK組細(xì)胞分別作為效應(yīng)細(xì)胞，CCK-8法檢測淋巴細(xì)胞殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示：DC-CIK組細(xì)胞對PC3細(xì)胞產(chǎn)生高細(xì)胞殺傷率(52.31±2.14)%，相比DC組(11.14±1.02)%、DC-T組(14.19±1.63)%和CIK組(34.43±2.01)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

表1 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12和IFN-γ 的濃度

*：P<0.05,與DC、DC-T、CIK組比較。

表2 細(xì)胞表型檢測

*：P<0.05，與DC、DC-T、CIK組比較。

*：P<0.05，與DC組、DC-T組和CIK組比較。

圖1 前列腺癌細(xì)胞殺傷活性檢測

3 討 論

前列腺癌是老年男性的常見惡性腫瘤之一，前列腺根治性切除術(shù)和放療是治療早期前列腺癌的有效手段。但對于局部進(jìn)展期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，目前卻沒有令人滿意的治療方法[1]。為此，本研究探討以DC-CIK為基礎(chǔ)的免疫途徑抗前列腺癌的作用。

DC-CIK細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞在抗腫瘤治療中因其增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高的廣譜抗瘤免疫等優(yōu)勢越來越引起人們的關(guān)注。目前，以自體DC-CIK細(xì)胞免疫療法來治療骨肉瘤、淋巴瘤等惡性腫瘤已顯示出良好的應(yīng)用前景[4]。研究發(fā)現(xiàn)，利用DC-CIK治療自體造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后復(fù)發(fā)的9例淋巴瘤患者，有2例患者部分緩解，2例患者病情穩(wěn)定，其中1例持續(xù)了18個(gè)月[5]。龔奕等[6]在對50例急性髓細(xì)胞白血病進(jìn)行自體DC-CIK細(xì)胞回輸治療中，發(fā)現(xiàn)患者總體生存率、無病生存率均高于對照組。盡管如此，DC-CIK細(xì)胞毒性增強(qiáng)的免疫效應(yīng)機(jī)制目前尚未完全明了。

DC是目前發(fā)現(xiàn)最有效的抗原提呈細(xì)胞，可攝取、加工、處理抗原，通過高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子、共刺激分子、細(xì)胞黏附因子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)以及淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(lymphocyte functionassociated antigen1，LFA-1)等細(xì)胞表面分子，在體內(nèi)外能有效激發(fā)初始和繼發(fā)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)，同時(shí)可分泌輔助性T細(xì)胞1型細(xì)胞因子IL-12，誘導(dǎo)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)產(chǎn)生IFN-γ和增強(qiáng)激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。CIK細(xì)胞是由多種細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3單克隆抗體等誘導(dǎo)的一種免疫活性細(xì)胞，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性與NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤特點(diǎn)，并通過分泌高水平的IL-12、IFN-γ等輔助性T細(xì)胞1類細(xì)胞因子，以調(diào)節(jié)體內(nèi)其他細(xì)胞因子的分泌達(dá)到促進(jìn)CIK對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的敏感性，起到抑制腫瘤和殺傷腫瘤的作用[7]。將具有強(qiáng)大腫瘤抗原提呈能力的DC與具有高效殺瘤活性的CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，二者可分別通過識別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)和發(fā)揮自身的細(xì)胞毒活性、分泌細(xì)胞因子協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，從而形成高效能的免疫效應(yīng)。本研究證實(shí)DC-CIK組培養(yǎng)上清液中IL-12、IFN-γ濃度水平明顯高于CIK組及其他兩組。可見，大量分泌細(xì)胞因子是DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤免疫效應(yīng)的重要機(jī)制。

本研究通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和CIK細(xì)胞，將其一起培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)物DC-CIK細(xì)胞對前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示DC-CIK細(xì)胞能產(chǎn)生強(qiáng)大的抗前列腺癌效應(yīng)，比同條件下單純CIK細(xì)胞抗腫瘤活性增強(qiáng)，與方慧云等[8]報(bào)道的DC-CIK細(xì)胞抗鼻咽癌免疫應(yīng)答效果一致。同時(shí)也證實(shí)DC-CIK細(xì)胞具有比CIK細(xì)胞更強(qiáng)的抗腫瘤活性。CIK細(xì)胞屬于異質(zhì)細(xì)胞群，其抗腫瘤作用與CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞及分泌細(xì)胞因子的水平密切相關(guān)。同時(shí)CIK細(xì)胞又是具有NK活性的T細(xì)胞，具有T細(xì)胞的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究結(jié)果表明，DC-CIK細(xì)胞具有高表達(dá)CD8+細(xì)胞和CD3+/CD56+細(xì)胞，即產(chǎn)生了大量的NK細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，使抗前列腺癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。同時(shí)DC的抗原提呈作用能促使CIK細(xì)胞分泌IFN-γ的時(shí)間延長，分泌量增加，進(jìn)一步增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。本研究結(jié)果顯示，DC-CIK細(xì)胞作為一類強(qiáng)大的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞，可作為一種抗前列腺癌的免疫治療方法。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59(4):225-249.

[2]Bedognetti D,Wang E,Sertoli MR,et al.Gene-expression profiling in vaccine therapy and immunotherapy for cancer[J].Expert Rev Vaccines,2010,9(6):555-565.

[3]Wang QJ,Wang H,Pan K,et al.Comparative study on anti-tumor immune response of autologous cytokine-induced killer (CIK) cells,dendritic cells-CIK (DC-CIK),and semi-allogeneic DC-CIK[J].Chin J Cancer,2010,29(7):641-648.

[4]Li XD,Xu B,Wu J,et al.Review of Chinese clinical trials on CIK cell treatment for malignancies[J].Clin Transl Oncol，2012,14(2):102-108.

[5]Leemhuis T,Wells S,Scheffold C,et al.A phase Ⅰ trial of autologous cytokine-induced killer cells for the treatment of relapsed Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma[J].Biol Blood Marrow Transplant,2005,11(3):181-187.

[6]龔奕,陳幸華,張曦,等.DC-CIK細(xì)胞輸注治療急性髓細(xì)胞白血病50例分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,40(30):3039-3041.

[7]Sangiolo D,Mesiano G,Carnevale-Schianca F,et al.Cytokine induced killer cells as adoptive immunotherapy strategy to augment graft versus tumor after hematopoietic cell transplantation[J].Expert Opin Biol Ther,2009,9(7):831-840.

[8]方慧云,程偉民,李曉玲,等.CIK、DC-CIK細(xì)胞抗鼻咽癌CNE2細(xì)胞的作用比較[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)院,2009,17(11):2077-2078.

[9]Joshi PS,Liu JQ,Wang Y,et al.Cytokine-induced killer T cells kill immature dendritic cells by TCR-independent and perforin-dependeant mechanisms[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1345-1353.