電針對非酒精性脂肪肝大鼠肝細胞角蛋白18表達的影響*

曾志華，曾明慧，黃學寬，周 萍△，陳 康

(1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400050；2.重慶醫科大學校長辦公室，重慶 400050；3.中國人民解放軍第三二四醫院，重慶 400020)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除過量飲酒及其他明確的肝損害因素所致的以肝細胞內脂質沉積和變性為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著肥胖癥和糖尿病患者的日益增多，NAFLD患病率迅速上升[2]。其發病機制尚不完全清楚,研究發現細胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)在NAFLD中的高表達導致脂質過氧化反應增強是脂肪肝發生、發展的重要因素[3]。近年來臨床采用針刺治療NAFLD療效確切[4-5]。本研究通過電針干預NAFLD大鼠，觀察大鼠肝臟CK18表達及肝內超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的變化,從而探討電針治療脂肪肝的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠購自重慶醫科大學動物實驗中心[動物使用許可證號：SCXK(渝)2007- 0001]；膽固醇購自上海生工化學試劑廠；豬油為市售；東寶肝泰片劑購自中國通化東寶藥業股份有限公司，配制成1%的混懸液；MDA、SOD、CK18抗體購自南京建成生物有限公司；即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；一次性無菌針灸針購自江蘇醫療用品有限公司。勻漿機、低溫離心機、加液器、紫外分光光度計、光學顯微鏡、圖像采集系統、圖像分析系統等設備由重慶醫科大學中醫藥實驗室和基礎醫學院提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 雄性SPF級Wistar大鼠43只，體質量(200±20)g,適應性飼養7 d，標記后分為正常組(n=11)和造模組(n=32)。造模組采用陳世清高脂飲食法建立NAFLD大鼠模型[6]，喂養飼料由20 g/L 膽固醇、100 g/L 豬油和880 g/L 普通飼料混合組成(由重慶醫科大學動物實驗中心按配方配制)。 8周后隨機處死正常組大鼠1只和造模組大鼠2只，取肝臟做病理組織學檢查以驗明造模情況。將余下的造模組大鼠30只予以標記后再分為3組:NAFLD模型組(n=10)、電針組(n=10)、藥物組(n=10)。模型組不做任何治療；電針組給予電針治療；藥物組給予東寶肝泰灌胃。根據活血化淤、化痰利濕的治則，取三陰交、豐隆、脾俞、陽陵泉穴。所取穴位參照《實驗針灸學》[7]定位。針刺方法:置大鼠于固定器中(重慶醫科大學中醫藥實驗室自制)中,取雙側穴位，用規格為0.3 mm×50 mm的毫針,分別剌入4 ～6 mm深度。然后接通電子針灸治療儀(蘇州醫療用品有限公司制造),采用強度2 V，頻率10 Hz的疏密波[8],疏波和密波自動交替，以大鼠下肢抖動為宜,保持清醒狀態,每天1次,每次20 min，連續4周。藥物組大鼠按照0.28 g/kg(1%的混懸液20 mL/kg)灌胃[9]，每天1次，連續4周。治療期間，模型組大鼠分別置入固定器中20 min，連續4周。正常組始終喂以基礎飼料，模型組、藥物組和電針組繼續飼以高脂飼料。

1.2.2 檢測指標及檢測方法 (1)肝臟生化指標檢測:取大鼠肝右葉,在4 ℃下加生理鹽水制成10%的肝勻漿液,3 000 r/min離心10 min后取上清液,SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶比色法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法,嚴格按試劑盒說明書進行檢測。(2)免疫組化檢查：肝臟以10%甲醛固定，常規石蠟切片(切片厚度約4 μm),每塊組織切片3張。采用CK18單克隆抗體進行免疫組化染色(ABC法)，DAB顯色，顯微鏡下觀察。CK18免疫組化顯示棕黃色顆粒為陽性,每張切片最少取20個高倍視野觀察棕黃色顆粒染色程度,用IPP6.1免疫組化分析軟件對圖片陽性區域進行累積光密度值(IOD)的量化測定。

2 結 果

2. 模型的驗證 實驗過程中，造模組大鼠體質量明顯增加、形體肥胖。肉眼可見造模組大鼠肝臟體積增大，顏色變黃；光鏡下HE染色顯示正常組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞呈放射狀整齊排列，造模組肝細胞出現中度至重度的脂肪變性，肝索紊亂，大量的肝細胞腫脹呈圓形，細胞間界限不清，偶爾可見碎屑樣壞死，細胞核被脂肪空泡擠到肝細胞的邊緣，病理學檢查可證實造模組大鼠脂肪肝已形成(圖1)。

A:正常組；B:造模組。

圖1 正常組與造模組大鼠肝組織病理切片(HE×400)

2.2 肝組織病理形態變化 至12周末，肉眼觀察正常組大鼠肝色鮮紅；模型組肝臟體積增大，顏色偏黃，電針組和藥物組大鼠肝色接近正常組。光鏡下:正常組肝小葉結構清晰，肝細胞形態正常，呈放射狀整齊排列；模型組肝細胞出現中度至重度的脂肪變性，肝索紊亂，大量的肝細胞腫脹呈圓形，細胞間界限不清，胞質內充滿以大泡型為主的脂肪空泡或脂滴，偶爾可見碎屑樣壞死；電針組肝臟病理形態接近正常組，肝細胞結構趨于正常，胞質疏松,肝竇增寬，極少數肝細胞內可見小脂滴，無炎性細胞浸潤；藥物組有少數肝細胞內可見小泡型脂滴，未見壞死及纖維組織增生，有少量炎性細胞浸潤。與模型組比較，電針組和藥物組大鼠肝組織脂肪變性程度和炎性損傷均有不同程度的改善，電針組改善較為明顯(圖2)。

A:正常組；B:模型組；C:電針組；D:藥物組。

圖2 各組大鼠肝組織病理學改變(HE×400)

**：P<0.01，與正常組比較；*：P<0.01，#：P<0.05，與模型組比較。

2.3 各組大鼠肝SOD和MDA含量變化 模型組與正常組比較，SOD顯著下降(P<0.01),MDA顯著升高(P<0.01) ；與模型組比較，電針組和藥物組SOD 顯著升高(P<0.01；P<0.05),MDA顯著降低(P<0.01；P<0.05)，見圖3。

2.4 各組大鼠肝組織CK18表達 CK18免疫組化顯示棕黃色顆粒為陽性。正常組幾乎未顯示陽性表達細胞；模型組顯示CK18陽性表達細胞數量比正常組明顯增多；與模型組比較，電針組和藥物組CK18陽性表達細胞數量均減少，電針組陽性表達細胞數量的減少更顯著(圖4)。

采用IPP6.1軟件對圖片陽性區域進行IOD測定，見圖5。與正常組比較，模型組IOD值顯著升高(P<0.01)，為強陽性表達；與模型組比較，電針組和藥物組CK18免疫組化IOD值顯著降低(P<0.01；P<0.05)。

A:正常組；B:模型組；C:電針組；D:藥物組。

圖4 各組大鼠肝CK18免疫組化染色(×400)

**:P<0.01，與正常組比較；*:P<0.01，#:P<0.05，與模型組比較。

圖5 各組大鼠肝CK18免疫組化IOD值變化

3 討 論

NAFLD發病機制極其復雜，“二次打擊”學說是目前比較公認的NAFLD的發病和進展機制，即胰島素抵抗(IR)和脂質過氧化(LP)。首次打擊主要指胰島素抵抗影響脂質代謝導致的肝細胞內脂質沉積和脂肪變性，形成單純性脂肪肝(NAFL)；二次打擊主要以脂質過氧化、促炎性細胞因子釋放等因素導致脂肪變性的肝細胞發生炎癥、壞死，引起非酒精脂肪性肝炎(NASH)。近年研究發現CK18與二次打擊所造成的肝損傷關系密切[10-11]。

CK18是表達于成熟上皮細胞的中間絲蛋白，是肝細胞凋亡和壞死過程中相對特異的一種蛋白。 CK18作為一種細胞壞死的生物標志物，被認為是新發現與NAFLD相關的指標，目前對CK18參與NAFLD機制的研究尚處于起步階段，許多研究結論尚存在分歧。CK18在肝細胞病理生理過程中起著重要作用，環境損傷如嗜肝病毒、藥物和乙醇等因素引起的持續損害使CK18基因發生了改變，導致CK18表達的異常從而使肝病進展甚至進入終末期[12]。研究發現CK18在肝臟“二次打擊”過程中發揮重要作用，參與NAFLD的發生和進展，以IR等因素導致的LP反應增強一方面造成肝細胞炎性壞死，促進CK18片段從壞死的肝細胞中釋放到血中[13],另一方面對肝造成持續損害，促使CK18 基因發生改變，導致肝CK18 表達異常，從而使NAFLD肝病持續發展至終末期[14]。SOD可有效清除體內超氧陰離子，其活性的變化間接反映機體內自由基的生成和代謝。MDA是脂質過氧化終產物,含量可間接反映脂質過氧化的程度。

本實驗結果表明，與模型組比較，病理學結果顯示電針組和藥物組大鼠肝脂肪變性程度和炎性損傷均有不同程度的改善；MDA含量均有不同程度的降低，SOD活性升高；免疫組化顯示肝CK18表達受到一定程度的抑制。以上研究結果證實電針治療在一定程度上改善了NAFLD大鼠的肝臟脂肪變性和炎性損傷。推測其機制可能是電針通過抑制NAFLD大鼠肝CK18表達的上調，減輕脂質過氧化反應,增強了機體的抗氧化能力,以此保護肝細胞免受損傷。

NAFLD在中醫學中無獨立的病名，可歸屬于“脅痛”、“肝著”、“積聚”等范疇。中醫認為其主要病機為肝脾氣化失司、痰濁內蘊、濕邪內生，致使后期腎精虧虛，肝、脾、腎功能失調，終致滯氣、淤血、痰濕相互搏結，痹阻于肝臟脈絡而成。臨床采用針刺療法治療本病，以達疏肝健脾、理氣燥濕、活血化淤之功，降脂作用肯定。實驗證明三陰交和豐隆穴可加快脂肪代謝和促進血液循環；脾俞和陽陵泉穴善長調節消化系統功能[15]。本次實驗針刺大鼠脾俞、豐隆、三陰交、陽陵泉穴，加用電針治療，使NAFLD大鼠獲得了明顯的療效。此研究結果對應用電針治療NAFLD有一定的參考價值。

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