評估高血磷對腎臟鈉磷協同轉運子基因表達影響的動物實驗研究*

張 川，金承洛△，李哲勛，鐔云輝，王萬輝，趙 柏，付宜鳴，劉 偉

(1.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院泌尿外科 150086;2.黑龍江省林業總醫院泌尿外科，哈爾濱 150086；3.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 150081)

近來研究顯示高磷血癥同慢性腎衰竭(CRF)、繼發性甲狀腺功能亢進、CRF心腦血管疾病等具有密切關系。磷的代謝主要通過腎臟和消化道，在正常情況下人體通過腎臟排出體外的磷約占總排出量的70%，經糞便排出約占30%[1-2]。健康成人磷的攝入和排泄基本相等，所以胃腸道和腎臟在維持機體磷代謝的平衡中顯得十分重要。目前大量研究證實，鈉磷(Napi)

表1 PCR引物序列

協同轉運子是生物體內細胞膜上一種依賴鈉的跨膜蛋白，它在調節細胞內磷代謝平衡中發揮了重要作用。目前從哺乳類動物的細胞膜上已分離出3種NaPi協同轉運子：NaPi-Ⅰ、NaPi-Ⅱ和NaPi-Ⅲ型協同轉運子，其中NaPi-Ⅱ又包括a、b、c 3個亞型[3]。故此本研究旨在進一步闡明高血磷同NaPi協同轉運子的相關性，為臨床進一步治療和研究高磷血癥及相關并發癥提出實驗參考和依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 48只6～8周SD大鼠，體質量190～200 g(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院動物實驗中心提供)，分成3組，每組16只：高血磷組(HP組)腹腔注射果糖二磷酸鈉(按1 mg/g注射)，低血磷組(LP組)按照AIN-93G標準，飼料含磷0.2%，含鈣0.5%，正常血磷組(NP組)按照AIN-93G標準，飼料含磷約0.6%～1.2%[4-5]。分別在相同環境下單獨飼養，在飼養的第1、2、4、6周每組各處死4只樣本，通過腹主動脈采血和留取腎臟皮質標本完成實驗。

1.2 方法

1.2.1 血清磷(P)、鈣(Ca)和甲狀旁腺激素(iPTH)檢測 在日立7600全自動生化分析儀上應用兩點法檢測血P、Ca和iPTH(試劑盒DSL-8000，美國 DPC)。

1.2.2 腎臟NaPi-Ⅱa mRNA和NaPi-Ⅲ-mRNA檢測 將大鼠腎臟皮質、髓質分開，取皮質約50 mg，TRIZOL法(Invitrogen公司)抽提RNA,Ult-rospec2000光電比色儀測定其純度和含量，所提取的RNA A260/A280需在1.8～2.0范圍內。取總RNA 1 μL，按逆轉錄試劑盒(ABI-RT試劑盒)以基因GAPDH為內參，引物序列主要參考文獻[6-7]進行設計(表1)。NaPi-Ⅱa、GAPDH引物由金思考特科技有限公司合成，NaPi-Ⅲ引物由上海生工生物技術服務公司合成。反應條件:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃復性 60 s,72 ℃延伸90 s，72 ℃最后延伸300 s，共35個循環。將PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，于紫外燈下拍照，采用天能GIS凝膠圖像分析系統(GI52010，編號70247-1)讀取各條帶吸光度(A)，比較此基因的相對表達水平，重復檢測3次以上。

2 結 果

2.1 不同飼料檢測結果 檢測結果顯示：LP組含磷0.19%，NP組含磷0.73%與預期標準一致。第6周HP組大鼠死亡1只，其余均存活至實驗處死。

2.2 大鼠血清生化指標檢測 各組血清P、Ca、iPTH動態觀察見表2～5。在第1、2、4、6周HP組較LP組和NP組血清P及iPTH均明顯增高(P<0.05),iPTH在飼養的第2周開始較第1周明顯升高，并且HP組iPTH的分泌量逐漸增加(P<0.05)。HP組、LP組和 NP組3個組中血清Ca差異無統計學意義(P>0.05)。在第2周開始，LP組血清P較NP組降低(P<0.05)，第6周iPTH及血清P均明顯下降(P<0.05)。

表2 術后第1周大鼠P、Ca、iPTH水平

表3 術后第2周大鼠P、Ca、iPTH水平

表4 術后第4周大鼠P、Ca、iPTH水平

表5 術后第6周大鼠P、Ca、iPTH水平

2.3 腎臟NaPi-Ⅱa、NaPi-Ⅲ mRNA半定量分析 所提取的RNA在Ult-rospec2000光電比色儀測定A260/A280均在1.8～2.0，RNA電泳可見5、18、28 s 3條清晰條帶(圖1、2)。確定抽 取物以RNA為主，無降解及污染。術后第1、2、4、6周HP組均較LP組和NP組血P增加明顯(P<0.05)，腎臟NaPi-Ⅱa表達明顯減少(P<0.01),同時HP組隨著時間的增加，NaPi-Ⅱa表達減少(P<0.05);LP組NaPi-Ⅱa較NP組在第4周開始明顯增加(P<0.05)；第1、2、4周HP組較LP組、NP組NaPi-Ⅲ mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，第6周NaPi-Ⅲ mRNA在HP組的表達比LP組和NP組增加(P<0.05)。LP組與NP組比較NaPi-Ⅲ mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，見表6。

圖1 腎臟NaPi-Ⅱa協同轉運子mRNA第2周表達情況

組別術后第1周NaPi-ⅡaNaPi-Ⅲ術后第2周NaPi-ⅡaNaPi-Ⅲ術后第4周NaPi-ⅡaNaPi-Ⅲ術后第6周NaPi-ⅡaNaPi-ⅢNP3.28±0.062.25±0.033.17±0.052.25±0.023.35±0.072.27±0.033.22±0.062.26±0.01LP2.53±0.072.24±0.012.85±0.042.19±0.043.13±0.052.26±0.023.57±0.072.26±0.02○HP2.25±0.06*2.25±0.021.87±0.07*#2.26±0.01▽1.11±0.12*#2.28±0.02▽0.98±0.09*#3.23±0.03△

*：P<0.05，與LP組、NP組在同一時間比較;#：P<0.05，與HP組內其他時間點比較；△：P<0.05，與LP組、NP組間比較；○：P>0.05，與NP組間比較；▽：P>0.05，與HP組內其他時間點比較。

3 討 論

在本次實驗中考慮到飼料中磷含量較高，會影響鈣的吸收[6]。所以對高磷組做了一定的調整，即采用正常飼養的同時注射果糖二磷酸鈉。HP組大鼠第4周iPTH明顯升高(P<0.05)，出現繼發性甲狀旁腺功能亢進表象。HP組在早期階段(第1周)即出現了明顯的高血磷癥，但從生化指標的測定結果分析可以看出，高磷飼養的HP組在不同的時間段血清iPTH具有一定的差異性(P<0.05)，但是在第1、2、4、6周HP、LP、NP 3個組中的血Ca無明顯的差異(P>0.05)，再次證實高血磷對iPTH的增加是不依賴血Ca的獨立原因[7]。體內磷代謝的動態平衡主要由甲狀旁腺激素(PTH)、1,25(OH)2D3、降鈣素(CT)等來調節維持[8]。故推測高血磷導致血中PTH水平升高，從而產生繼發性甲狀旁腺功能亢進(SHPT)，以增加血磷轉化，代償性使尿磷的重吸收減少，以適當緩解高磷血癥，減輕PTH的進一步惡化。

盡管目前腎臟NaPi-ⅡmRNA表達減少的機制尚不清楚，但已證明NaPi-Ⅱa主要位于近端腎小管的刷狀緣膜上，是腎臟近曲小管中重吸收細胞外磷的主要轉運子，其中NaPi-Ⅱa發揮主導作用。NaPi-Ⅱc也具有一定的意義，其主要位于近端腎小球細胞的基膜側。NaPi-Ⅱa基因的表達調控主要在轉錄后水平。在動物實驗中位于NaPi-Ⅱ a mRNA交叉編碼區的心血管激活因子以及3′端非翻譯區影響腎臟胞漿蛋白的轉錄活性。NaPi-Ⅱa的功能受到多種激素或者非激素類物質的影響[9]。本研究結果顯示HP組在術后第1周NaPi-Ⅱa mRNA表達較NP組明顯下降(P<0.05)，與Lostscher等[10-11]報道一致。但本研究中HP組出現高P及高PTH血癥，同時NaPi-Ⅱa mRNA表達減少，提示高P及高PTH血癥影響NaPi-Ⅱa協同轉運子在腎臟的表達，且可能通過減少腎小管NaPi-Ⅱa mRNA的表達量，促使尿磷的重吸收減少，以適當緩解高磷血癥。在實驗中還發現低磷飼養的LP組中NaPi-Ⅱa轉運子mRNA的表達較NP組在第4周開始明顯增加，說明大鼠近端小管NaPi-Ⅱa轉運子mRNA的表達與抑制同高磷飲食和血清PTH具有密切的相關性，但同血清鈣等無明顯關系。目前研究顯示NaPi-Ⅱa的表達和作用還常與GABA受體相關蛋白、Na+/H+交換子調節因子PDZ蛋白、NHERF1和NHERF3有關，通過對這些蛋白的影響可以影響NaPi-Ⅱa 表達增加或者降低[12]。NaPi-Ⅲ協同轉運子參與人和大鼠甲狀旁腺細胞對磷的轉運，是生理或病理狀態下維持細胞內磷濃度的重要物質，目前證實NaPi-Ⅲ有2個亞型:Pit-1和Pit-2，但在人平滑肌細胞及大鼠甲狀旁腺一般只表達Pit-1。甲狀旁腺細胞作為合成PTH的唯一場所，其胞膜上對負責攝取磷而直接影響PTH合成的NaPi-Ⅲ應起著關鍵性的作用[13-14]。在本實驗中可以發現，隨著血磷的增加，iPTH隨之增加，同時在第6周HP組NaPi-ⅢmRNA表達較LP組與NP組增加(P<0.05)，說明高磷通過作用于NaPi-ⅢmRNA高表達促進PTH分泌,同時促進細胞內磷升高,以減輕高血磷癥狀。然而NP組與LP組差異卻無統計學意義(P>0.05)。腎性骨營養不良以前稱為腎性骨病,包括高轉化性骨病(又稱甲狀旁腺功能亢進性骨病)、低轉化性骨病(分為骨軟化和骨再生不良兩種)和混合性骨病3種類型,是CRF患者常見并發癥。Hirotaka等[15]研究發現Slc20al(Pit-1)是NaPi-Ⅲ協同轉運子中的一員，它在大鼠的成骨過程和骨的礦化過程起著關鍵的作用。在第6周HP組NaPi-ⅢmRNA較LP組表達升高，可能與骨的礦物質代謝有關。迄今對于NaPi-Ⅲ的功能研究甚少，因此本研究為進一步開展NaPi-Ⅲ協同轉運子在SHPT發生發展中的作用及機制的研究奠定了基礎，可以為臨床治療SHPT尋找新的途徑，SHPT時除加強降磷治療外，對NaPi-Ⅲ協同轉運子功能的調節和阻斷可以成為以后研究的方向，且具有非常重要的意義。

高磷血癥作為一種獨立的疾病危險因素，越來越引起人們的重視，高磷血癥的防治將有效地降低各項并發癥、提高患者生活質量、降低病殘率和病死率。本研究發現高磷環境下NaPi協同轉運子的基因表達介導了磷的轉運，促進了SHPT等的發生。磷主要經胃腸道攝入,經腎臟排出。高磷血癥的防治措施主要包括限制磷攝入和促進磷排出,因此，高磷血癥的研究及治療中，NaPi協同轉運子是一個較好的突破點，需要進一步的深入研究。

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