七氟醚對初級感覺神經(jīng)元突觸前抑制的作用*

陳夢潔，馬克濤，2，司軍強，2，3，4，樊 超，李 麗，2△

(1.石河子大學醫(yī)學院生理教研室,新疆石河子 832002;2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,新疆石河子 832002;3.武漢大學基礎醫(yī)學院,武漢 430071;4.華中科技大學基礎醫(yī)學院，武漢 430071)

七氟醚是一種較新的鹵族吸入麻醉劑，與其他麻醉藥物相比，其優(yōu)點是誘導迅速、刺激性小、溶解度低及較好的血流動力學穩(wěn)定性，并且吸收和清除迅速，并發(fā)癥少，這些特性使其成為一種理想的吸入性麻醉藥物廣泛應用于臨床。但是，吸入性麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制尚未完全闡明[1]。以往的研究證明吸入性麻醉藥物如氟烷、異氟烷、七氟烷在脊髓水平有明顯的抗傷害感受作用[2]。近年來，越來越多的證據(jù)支持麻醉藥物通過加強抑制性突觸功能而發(fā)揮作用[3]。γ-氨基丁酸(GABA)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，作為最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，在傷害性信息處理或痛覺調(diào)制中發(fā)揮重要作用，目前已經(jīng)證實GABA受體主要參與痛覺的傳遞[4]。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細胞是軀體感覺信息的初級傳入神經(jīng)元，在疼痛的發(fā)生和維持中起著重要的作用[5]。本實驗擬用膜片鉗技術在DRG細胞上檢測七氟醚對GABA激活電流的影響，探討七氟醚在初級感覺突觸前(脊髓)發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選用4周齡SD大鼠(150～200 g)，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量符合一級標準。膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、GABA、HEPES 為 Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Axon 700B放大器(美國Axon公司)、P-97拉制儀(美國Sutter公司)、生物電信號記錄計算機(Axoscope 10.2 軟件，美國Axon公司)。

1.2 方法 將大鼠擊昏、斷頭后迅速切開背部皮膚，沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨及軟組織，取出頸、胸、腰段脊柱。由脊柱正中縱向剖成兩半，置于細胞外液中，外液成分(mmol/L)：NaCl 150、KCl 5、CaCl22.5、MgCl21、HEPES 10、D-glucose 10，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.3～7.4，溶液滲透壓為330 mOsm。由剖開的椎管內(nèi)側(cè)棄去脊髓，逐個取出神經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)根，在顯微鏡下用精細角膜剪和游絲鑷子剪除相連的神經(jīng)根和周圍的結(jié)締組織被膜，將修剪干凈的DRG剪碎成2～3塊，轉(zhuǎn)移到加有胰蛋白酶0.25 mg/mL、膠原酶0.5 mg/mL的EP管中，置于37 ℃的恒溫恒濕箱內(nèi)15 min。取出放入少量的胰蛋白酶抑制劑終止其繼續(xù)消化。將上述機械分離和酶處理的DRG神經(jīng)元進行離心(1 000 r/min離心 6 min)，棄去上清液，采用膜片鉗實驗將DRG細胞外液移入沉淀中，吹打使其分散后移入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入細胞外液，在室溫靜置至少30 min，待細胞貼壁后進行試驗。

使用Axon 700B放大器進行全細胞膜片鉗實驗記錄，記錄電極尖端直徑約為1 μm，電極阻抗約為3～5 Mμ，由P-97拉制儀二步拉制，電極充灌內(nèi)液成分(mmol/L)：KCl 140、CaCl21、MgCl22、HEPES 10、EGTA 11，KOH調(diào)節(jié)pH為7.3～7.4。實驗在倒置顯微鏡下，選用分離的單個細胞呈圓形或橢圓形，貼壁良好、輪廓及形態(tài)清晰、胞膜完整有光暈、折光性強且胞質(zhì)均勻的中小細胞，細胞直徑15～45 μm。通過微操縱器將玻璃微電極移至細胞表面后給予負壓吸引，電極與細胞膜形成高阻(>1 GΩ)封接后將膜吸破，然后調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻保持電壓為-60 mV，膜電流應用低通濾波(10 Hz)。

藥物均用無糖外液配制，七氟醚在實驗前30 min之內(nèi)配置，給藥系統(tǒng)為密閉的，通過微操縱器移動快速換液裝置的排藥管進行，排藥管每管的直徑為0.5 mm，管口距所記錄的細胞100 μm，實驗在室溫20～30 ℃進行。細胞外灌流GABA給藥順序由低濃度到高濃度依次進行，給藥時間為5～6 s，給藥間歇為4 min，給藥間歇用細胞外液沖洗。給七氟醚混合液時，同上先灌流相同濃度的GABA引出電流作為前對照，待IGABA穩(wěn)定后，洗脫4 min后持續(xù)預灌流七氟醚10 s，然后灌流5 s GABA和七氟醚的混合液，洗脫至IGABA恢復到前對照水平后，灌流另一濃度的七氟醚。記錄不同濃度七氟醚對IGABA的增強作用，并計算七氟醚對IGABA的增強率=(I混合-IGABA)÷IGABA×100% 。

2 結(jié) 果

2.1 DRG細胞GABA激活電流 實驗共檢測了106個細胞，其中大多數(shù)(86.8%，92/106)對GABA敏感。GABA(1～1000 μmol/L)激活的內(nèi)向電流具有明顯去敏感性，且具有濃度依賴性(P<0.05,n=6)，見圖1。本實驗室已經(jīng)驗證此反應可被GABAA受體特異性激動劑蠅蕈醇(100 μmol/L)模擬，被GABAA受體選擇性拮抗劑荷包牡丹堿(100 μmol/L)阻斷(圖2)[6]。提示GABA激活的內(nèi)向電流由GABAA受體所介導。

2.2 七氟醚對GABA激活電流的增強作用 預灌流七氟醚(30～3 000 μmol/L)10 s后對GABA(10～100 μmol/L)激活電流產(chǎn)生明顯的調(diào)制作用，在92個對GABA反應敏感的神經(jīng)元中：七氟醚對其中81個神經(jīng)元(88.04%，81/92)膜上GABA激活電流產(chǎn)生增強效應；對2個神經(jīng)元(2.17%，2/92)無明顯作用；對11個神經(jīng)元(11.96%，11/92)呈現(xiàn)抑制作用。其中還發(fā)現(xiàn)在61.96%(57/92)的DRG神經(jīng)元膜上，當七氟醚的濃度為300～3 000 μmol/L時可引起一個外向電流(見圖3)。

2.2.1 七氟醚非濃度依賴性的增強GABA(100 μmol/L)激活電流 預灌流七氟醚(30～3 000 μmol/L)對GABA(100 μmol/L)激活電流的增強作用與七氟醚呈非濃度依賴性，七氟醚的濃度為100～3 000 μmol/L時對GABA激活電流的增強作用具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=6),當七氟醚的濃度分別為100、300、1 000、3 000 μmol/L時對GABA(100 μmol/L)激活電流的增強率分別為34.17%±4.85%、44.25%±9.48%、41.42%±7.26%、18.98%±0.67%，可以看出當七氟醚濃度為300 μmol/L時對GABA(100 μmol/L)激活電流增強作用最明顯(P<0.05,n=6),見圖3。

圖1 GABA激活的濃度依賴性的內(nèi)向電流

圖2 荷包牡丹堿對GABA激活內(nèi)向電流的影響

A：不同濃度七氟醚對100 μmol/L GABA激活電流的增強率。與30 μmol/L組比較，*P<0.05；與300 μmol/L組比較，#P<0.05；與1 000 μmol/L組比較，&P<0.05；與300 μmol/L組比較，&P<0.05。B：不同濃度七氟醚對100 μmol/L GABA激活電流的增強比值。與control組比較，*P<0.05；與30 μmol/L組比較，#P<0.05 ；與100 μmol/L組比較，△P<0.05。

圖3 七氟醚對100 μmol/L GABA激活電流的增強作用

2.2.2 七氟醚對GABA激活電流的增強作用與GABA呈濃度依賴性 預灌流100、300、1000 μmol/L七氟醚對GABA激活電流的增強作用與GABA呈濃度依賴性(圖4)，七氟醚對較小濃度的GABA(10 μmol/L)激活電流的增強率最大，即增強作用最明顯(P<0.05,n=6)，當七氟醚的濃度為100、300、1 000 μmol/L時對GABA(10 μmol/L)激活電流的增強率分別達124.63%±22.87%、186.88%±30.69%、153.65%±28.94%。可以看出當七氟醚的濃度為300 μmol/L時對GABA(10～100 μmol/L)激活電流的增強作用最明顯(P<0.05,n=6)，見圖4。

*:P<0.05,與100 μmol/L組比較，；#:P<0.05,與50 μmol/L組比較。

圖4 不同濃度的七氟醚對不同濃度的GABA激活電流的增強作用

3 討 論

實驗結(jié)果顯示，不同濃度的七氟醚(100～3 000 μmol/L)均能增強大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞GABA激活的電流，當七氟醚濃度為300 μmol/L時增強作用最明顯，達44.25%±9.48%。七氟醚對GABA激活電流的增強作用與GABA呈濃度依賴性，對較小濃度的GABA(10 μmol/L)激活電流的增強作用最明顯，其中300 μmol/L的七氟醚對10 μmol/L GABA激活電流的增強率為186.88%±30.69%。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，它在脊髓背角通過突觸前抑制作用，減少初級傳入神經(jīng)末梢興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，即“突觸前抑制”[7]。當GABA的濃度越低時，GABA能系統(tǒng)在初級感覺傳入終末產(chǎn)生的突觸前抑制作用越弱，而本實驗中七氟醚對較低濃度GABA激活電流的增強作用較明顯，可能的原因是七氟醚可以通過增強GABA對GABA受體的親和力，來發(fā)揮抗傷害的作用。羅愛林等[8]證明當七氟醚的濃度超過3 000 μmol/L時，GABA激活電流的峰值會下降，這可能與部分阻塞氯通道有關，因此，本次試驗采用七氟醚的濃度為30～3 000 μmol/L。GABAA受體復合物是一個多亞基配體門控的離子通道，一些藥物可以作用于GABAA受體復合物而產(chǎn)生類似GABA反應發(fā)揮作用，例如巴比妥類、苯二氮卓類、類固醇類和異丙酚類等藥物。有研究證明，七氟醚在海馬神經(jīng)元可引起一種內(nèi)向電流，而且該電流可被荷包牡丹堿阻斷，這表明該電流和GABAA受體有關[9]。還有一些全身麻醉藥物可通過增加該受體復合物中氯通道的平均開放時間或開放頻率而增強GABA作用[10]。并且Jones等[10]還證明3種吸入性麻醉藥物(氟烷、恩氟烷、異氟烷)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上可加強GABA激活的氯電流。Wu等[11]推斷GABAA受體上似乎存在一個對于許多吸入麻醉藥的結(jié)合位點，而臨床濃度的七氟醚所通過的結(jié)合位點和苯巴比妥或地西泮是不同的。另外徐宏偉等[12]采用放射配體結(jié)合分析法，進行抑制實驗及飽和實驗，也進一步證實七氟醚可提高GABA與GABAA受體的親和力，但不影響GABA的結(jié)合位點。

在臨床麻醉中根據(jù)患者的年齡和麻醉方法的不同，七氟醚的最低肺泡有效濃度(minimumalveolar concentration,MAC)為1.48%～2.03%，相應的血藥濃度是340～470 μmol/L，本實驗中接近這個濃度的七氟醚濃度是300 μmol/L，臨床上MAC的七氟醚(680～940 μmol/L)可以作為惟一使用的麻醉藥誘導后氣管內(nèi)插管，這和本次實驗中應用的1 000 μmol/L的七氟醚很接近，但由于在手術室中七氟醚很少單獨使用，通常七氟醚是混合著氧氣一起使用，這會使七氟醚實際進入血液的濃度降低，所以在臨床中七氟醚經(jīng)常使用的濃度和本次試驗中對GABA激活電流的增強作用最明顯的七氟醚濃度是十分接近的。

本實驗采用膜片鉗技術在DRG細胞上檢測到七氟醚對GABA激活的電流有增強作用，當GABA濃度越低時GABA能系統(tǒng)在初級感覺傳入終末產(chǎn)生的突觸前抑制作用越弱，而七氟醚卻對較低濃度的GABA激活電流的增強作用最明顯，這可以部分解釋七氟醚在初級感覺突觸前(脊髓)發(fā)揮麻醉作用的可能機制。

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