PD-ECGF基因上調在PCI術后血管內膜損傷修復中的作用研究*

朱晉坤，毛 華,尹揚光，董 文，鄧夢揚，魯玉明，熊宗華，杜 峰，文 美，劉廷筑

(1.貴州省貴陽市第一人民醫院心內科 550002；2.重慶市第六人民醫院重癥醫學科 400060)

經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是心肌梗死或不穩定型心絞痛血管重建的首選方法，能夠有效地恢復冠狀動脈血流，降低患者的病死率。然而，由于其術后易發生冠狀動脈再狹窄，從而嚴重影響了該療法的遠期效果。研究表明，早期裸支架植入PCI術后血管再狹窄發生率可達40%；雖然隨著藥物洗脫支架的運用，這一并發癥發生率有所降低，但仍達到11%[1]。

防治PCI術后靶血管再狹窄及重建靶血管生物學功能的關鍵在于加速靶血管段的內皮覆蓋、抑制局部平滑肌細胞過度增殖及促進受損血管的修復。最近的研究表明,使用促進血管生長的基因可加快和增加局部缺血患者側支動脈的發展和促進血管再生[2-3]。血小板衍化內皮細胞生長因子(PD-ECGF)又被稱為胸苷磷酸化酶(TP)，其具有趨化內皮細胞和促進血管生成的作用。在活體動物血管疾病研究中發現，PD-ECGF基因轉染具有促進血管生成的作用[4]。本研究將PD-ECGF基因轉染入兔頸動脈球囊損傷模型,探討PD-ECGF基因是否擁有促進損傷血管再內皮化、抑制內膜增生及改善PCI術后靶血管再狹窄的作用，也為將來降低PCI術后靶血管不良重構和再狹窄提供一種新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只雄性新西蘭白兔，6月齡，體質量2.5～3.0 kg，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 家兔頸總動脈球囊損傷模型的建立及干預 動物適應性喂養2周后，分為對照組(n=18)和實驗組(n=18)，并行左頸總動脈球囊損傷術，具體步驟和方法參閱文獻[4-5]報道。實驗組新西蘭白兔于損傷頸總動脈內注入PD-ECGF基因(病毒含量1×1010cfu/100 μL，共0.1 mL，由上海吉凱基因生物技術公司合成)，保留10 min；對照組則注入同等體積的交付劑無菌生理鹽水保留10 min。為了更好地促進PD-ECGF基因的轉染，實驗組損傷動脈外膜給予含PD-ECGF基因(病毒含量1×1010cfu/100 μL，共0.1 mL)的40% gel F-127促進轉染；對照組則給予不含病毒的0.1 mL 40% gel F-127處理。隨后，生理鹽水清洗手術切口，逐層縫合皮下組織與皮膚。術后給予青霉素10×104U/kg肌肉注射預防感染。

1.2.2 病理組織學檢查 Evans藍染色：3周后，取實驗組和對照組家兔各6只，經耳緣靜脈注入0.5%Evans藍，取頸動脈損傷節段，沿血管長軸剪開，平鋪觀察著色情況(著色部分為損傷后仍未修復的內皮)，并計算內皮細胞覆蓋率[內皮細胞覆蓋率=內皮細胞覆蓋面積(IA)/總面積(TA)]。HE染色：3周后，兩組各取家兔6只，收集頸動脈損傷節段約1.5～2.0 cm，甲醛溶液固定，梯度脫水，石蠟包埋并切片(5 μm)。HE染色后測量平均內膜厚度、平均中膜厚度及內膜面積與中膜面積比值(I/M)。內膜面積=內彈力膜包繞面積-管腔面積，中膜面積=外彈力膜包繞面積-內彈力膜包繞面積。

1.2.3 PD-ECGF免疫組化染色 各組石蠟切片(5 μm,n=6)行PD-ECGF免疫組化染色，具體方法見參考文獻[6]，一抗為鼠單克隆PD-ECGF(Santa公司，1∶500)，二抗為山羊抗小鼠(北京中杉公司，1∶3 000)，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。免疫組化結果判定:PD-ECGF表達陽性和陰性，根據細胞染色強度和染色細胞所占面積二者積分之和來判斷。染色強度積分為:不染色=0,輕度染色=1,中度染色=2,強染色=3;染色面積積分為:無細胞染色=0,<25%細胞染色=1,25%～50%細胞染色=2,>50%細胞染色=3。若兩種積分之和大于2,則為PD-ECGF表達陽性,≤2則為表達陰性[7]。

1.2.4 免疫印跡法檢測PD-ECGF蛋白表達 3周后，處死2組各6只家兔，收集頸動脈損傷節段約2～3 cm，提取組織總蛋白并測定蛋白濃度，各組取40 μg全蛋白在SDS-PAGE凝膠中進行電泳,隨后，蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,加一抗[小鼠單克隆PD-ECGF(1∶1 000)和小鼠單克隆β-actin(1∶2 000)],4 ℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶4 000),室溫孵育2 h，洗膜后使用化學發光法在Bio-Rad 分子成像儀上成像。

2 結 果

2.1 Evans藍染色 動物喂養3周后實驗組和對照組管壁均有白色不著色部分，呈斑片狀，內皮覆蓋率分別為(72.8±4.0)%和(33.6±7.4)%;實驗組內皮覆蓋率顯著高于對照組(P<0.05)，見圖1、2。

A：實驗組；B：對照組。

圖1 典型頸動脈Evans藍染色

2.2 HE染色 HE染色顯示，3周后對照組血管內膜明顯增厚，平滑肌細胞排列紊亂，而實驗組血管內膜增生顯著減輕，中膜平滑肌及膠原組織增生均無對照組明顯(圖3)。兩組平均內膜厚度、平均中膜厚度及I/M見表1。

*:P<0.05，與對照組比較。

圖2 對照組和實驗組內皮覆蓋率情況

A:對照組；B:實驗組。

圖3 頸動脈HE染色(×100)表1 兩組平均內膜厚度、平均中膜厚度及

*:P<0.05,與對照組比較。

A:對照組；B：實驗組。

圖4 PD-ECGF 在頸動脈組織中的表達(×200)

*：P<0.05，與對照組比較。

圖5 PD-ECGF在頸動脈中染色面積和染色強度積分和改變情況

2.3 免疫組織化學染色分析 PD-ECGF 在頸動脈組織中主要表達于血管內皮細胞、間質細胞，染色主要在細胞質和細胞核內(圖4、5)。實驗組中PD-ECGF 陽性表達率顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 免疫印跡法檢測PD-ECGF表達 免疫印跡法檢測證實實驗組PD-ECGF蛋白在受損頸動脈細胞中的表達明顯高于對照組(P<0.01),見圖6。

A：3周后PD-ECGF蛋白表達，B：PD-ECGF/β-Actin相對灰度值。

圖6 免疫印跡法檢測PD-ECGF表達

3 討 論

PCI術后血管內皮細胞層不可避免地受到損傷，內皮層完整性的破壞是血栓形成的起始環節，這也將啟動血管壁粥樣斑塊的進程，并導致內膜反應性增生[8]。內皮損傷的自我修復是個漫長的過程，在內皮層修復前，血液中存在的血管活性物質與內皮下血管壁接觸，一方面引起血栓形成，另一方面，血管平滑肌細胞在這些活性物質的刺激下也發生反應性的增生，結局是血管再狹窄的發生。

PD-ECGF最早于1987被提取出，大量的實驗證明了PD-ECGF與腫瘤血管生成之間的關系[9-10]。PD-ECGF是一個相對分子質量55×103的多肽，在體內是常以110×103的二聚體存在,是內皮細胞的有絲分裂原，而PD-ECGF作為一種血管生長因子，在體內與體外都被證實有血管新生作用[9-11]。PD-ECGF也是嘧啶核苷合成和分解代謝中一個重要的酶，能同時催化胸腺嘧啶核苷去磷酸化為胸腺嘧啶和2-脫氧-核糖-1-磷酸并且催化以上2種物質代謝為β-氨基異丁酸和2-脫氧-D-核糖，這些物質都具有明顯刺激血管生成和促進血管延長作用[12-13]。目前對于PD-ECGF促進血管生成作用的機制公認為：(1)PD-ECGF促進血管生成作用是通過其酶活性而達到的；(2)酶活性作用降低了細胞內外胸腺嘧啶核苷及其他抑血管生成物的濃度；(3)PD-ECGF的代謝產物中含有促進血管生成的物質[14]。體外實驗研究表明，受損的內皮細胞可通過攝取血小板內的PD-ECGF調節自身內環境的平衡，從而使損傷得以修復。另外，在體外實驗中PD-ECGF能抑制平滑肌細胞的增殖[15-16]。這些研究充分提示了PD-ECGF在預防損傷血管再狹窄中可能發揮較大的作用。

本實驗發現，與對照組相比，家兔頸動脈球囊損傷后轉染PD-ECGF基因，能明顯提高損傷動脈的內皮覆蓋率。此外，HE染色發現血管內膜增生顯著減輕，中膜平滑肌及膠原組織增生均不明顯，管腔狹窄率與對照組相比也顯著減低。以上表明，PD-ECGF基因能有效促進損傷后血管內皮細胞的修復，同時也能有效抑制平滑肌細胞的過度活化增殖，從而使血管發生再狹窄的比例也顯著下降。本研究通過免疫組化染色和免疫印跡法分析發現，3周后實驗組PD-ECGF表達水平明顯高于對照組，可見，PD-ECGF基因通過簡單的轉染方式在實驗組家兔頸動脈中也得到了有效的表達。事實上，PD-ECGF除了能促進血管生成外，還能抑制血管平滑肌細胞增殖和促進其凋亡。作者推測，PD-ECGF可能通過多種途徑來促進內皮細胞和血管的生成，以及抑制血管平滑肌細胞增殖，其具體的分子機制作者將在下一步的研究中深入闡述。

綜上所述，PD-ECGF基因的轉染在損傷血管中表現出了趨化內皮細胞、促進血管生成和抑制平滑肌細胞增殖的作用，這提示PD-ECGF基因轉染治療對頸動脈球囊損傷后預防血管再狹窄有較好的療效。PD-ECGF基因轉染可為PCI術后防治血管再狹窄提供新的思路、觀念。

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