小青龍湯對哮喘小鼠氣道變應性炎癥作用的研究*

吳 奎，王 彥，畢玉田，肖貞良

(1.成都軍區總醫院呼吸內科，成都 610083；2.第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸內科研究所，重慶 400038；3.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所呼吸內科，重慶 400042)

支氣管哮喘是一種常見的由Th2細胞介導的、對變應原免疫耐受缺陷的疾病。哮喘患者在接觸變應原時，調節性T細胞對Th2反應的調節作用減弱，使得CD4 T發生Th2偏移，從而分泌產生大量的白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13等Th2型細胞因子，誘導產生氣道變應性炎癥、黏液分泌增加、氣道平滑肌痙攣，長期反復發作，甚至引起氣道重建，導致氣道狹窄，使患者出現喘息、呼吸困難等癥狀[1-2]。

哮喘的治療主要是依據世界衛生組織制定的《哮喘全球創議》與中華醫學會呼吸病學分會制定的《支氣管哮喘防治指南》進行。這兩份指南大同小異，其治療的主要藥物都是吸入的糖皮質激素與長效β2腎上腺素受體激素的復方制劑。根據這兩份指南進行治療，大部分患者可以得到較好的控制，然而，臨床應用中往往遇到各種問題，特別是在經濟較不發達的地區。由于經濟問題，患者往往難以長期用藥；且患者對吸入激素也存在顧慮，使得我國的哮喘控制水平極低，大部分患者未能得到很好的治療。

中醫藥是我國的傳統醫療方法，很早就已經應用于哮喘的治療。中醫傳統理論認為，外寒內飲是哮喘的基本病因，患者外感風寒之邪，內傷生冷，或素體陽虛，寒痰內伏，易引動伏邪壅阻肺氣，宣降失職，氣道受阻，則咳嗽氣喘。小青龍湯出自張仲景《傷寒論》，由麻黃、桂枝、芍藥、細辛、干姜、灸甘草、五味子、半夏等8味中藥組成。《傷寒論》：“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹滿，或喘者，小青龍湯主之。……心下有水氣，咳而微喘，發熱不渴者，小青龍湯主之。……小青龍湯，治咳逆倚息不得臥”。長期以來，小青龍湯已經應用于支氣管哮喘的治療，并取得良好療效[3-4]。然而，小青龍湯對哮喘過程中免疫學功能的影響仍不清楚。本研究觀察小青龍湯對哮喘小鼠模型肺部變應性炎癥的作用，并檢測了此過程中Th1、Th2與調節性T細胞的變化，旨在初步明確小青龍湯的作用，為深入探討小青龍湯的作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～10周雌性BALB/c小鼠，體質量20.2 g，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。動物分為正常對照組(對照組)、OVA致敏/激發組(哮喘組)、小青龍湯治療組(治療組)，各8只。

1.2 儀器與試劑 純化塵卵蛋白(OVA,grade V)購自美國Sigma公司。IL-4、IL-5、干擾素(IFN)-γ、IL-10 ELISA檢測試劑盒購自美國BD公司。熒光標記的Foxp3、CD4、CD25抗體及同型對照抗體購自美國eBioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 致敏及激發步驟 分別于第1、15天腹腔注射含有80 μg卵蛋白的生理鹽水溶液100 μL與等體積的鋁佐劑的混合物，于第25～27天每天定時霧化吸入1%卵蛋白-生理鹽水溶液30 min，霧化器產霧量為0.5 mL/min。對照組致敏及激發步驟同哮喘組，每次注射相同體積的生理鹽水，霧化吸入生理鹽水。在激發期間，治療組小鼠以小青龍湯煎劑代替每日飲水。

1.3.2 小青龍湯制備 參照許濟群主編《方劑學》制備：麻黃(去節)9 g，芍藥9 g，細辛3 g，干姜3 g，炙甘草6 g，桂枝(去皮)6 g，半夏9 g(洗)，精確稱取傳統飲片，加水200 mL浸泡15 min，大火煎沸后小火煎30 min，趁熱過濾，藥渣再加500 mL水，煎20 min，趁熱過濾，合并兩次煎液，濃縮至500 mL，4 ℃保存備用。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗和取血 在第28天(最后1次霧化吸入激發后24 h)，小鼠以0.3%戊巴比妥0.3 mL腹腔注射麻醉后，眼眶取血，保存在肝素抗凝管內，常溫下5 000 r/min離心5 min，血清移至另一干凈Eppendorf管，-20 ℃保存待測。再切開氣管行氣管插管，以0.2 mL PBS灌洗2次，灌洗液回收率大于80%。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞總數和分類計數 常溫下1 500 r/min離心BALF 10 min，收集上清液，用以測定IL-4、IL-5和干擾素(IFN)-γ。細胞沉淀用0.1 mL PBS重懸，取少許進行細胞計數。其余細胞沉淀再次離心后，棄上清液，用少許PBS重懸后涂片，晾干后進行瑞氏染色。光學顯微鏡下計數500個非鱗狀上皮細胞，并進行嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞分類計數，計算所占的百分比。

1.3.5 細胞因子檢測 IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的檢測方法參照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3.6 流式細胞學檢測 將前分離所得的外周血沉淀部分以1.5 mL PBS重懸，再以等體積Hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細胞分離液，使之懸于細胞懸液的上層，2 000 r/min離心20 min。取出試管，輕輕吸取液相交界的細胞，加入Hanks液3 mL，混勻后1 500 r/min離心5 min。去上清液，細胞加入完全培養基，將細胞濃度調整為2×106/mL，根據說明書將細胞以相關抗體標記后，用流式細胞儀檢測Foxp3+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例。BALF細胞濃度調整為2×106/mL，根據說明書將細胞以相關抗體標記后，用流式細胞儀檢測Foxp3+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例。

2 結 果

2.1 BALF細胞學改變 哮喘組的肺部表現以嗜酸性粒細胞氣道炎癥為特征，同時有多種炎性細胞的浸潤，經小青龍湯治療后，肺部炎性浸潤明顯減輕(圖1)。結果表明，哮喘組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞比例顯著增加，同時細胞總數及各類炎性細胞數量也顯著增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。而治療組小鼠BALF中細胞總數、細胞分類計數均較哮喘組顯著下降，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

A：哮喘組；B：治療組；C：對照組。

圖1 3組小鼠肺部病理切片表1 小鼠BALF中細胞總數和分類計數的 變化

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與哮喘組比較。

2.3 BALF和血漿中IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的水平 為判斷小青龍湯對Th2型偏移的作用，本研究檢測了BALF和血漿中IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-10的水平。結果表明：哮喘組小鼠外周血血漿中IL-4、IL-5水平顯著高于對照組 (P<0.01)，IFN-γ的水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而IL-10水平顯著低于對照組(P<0.01)，經小青龍湯治療后，IL-4、IL-5、IL-10水平顯著升高，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；各組IFN-γ水平差異均無統計學意義(P>0.05)。BALF中各細胞因子出現類似表現(表2、3)。

2.4 BALF中CD4+T細胞亞型的變化 流式細胞儀檢測結果表明，哮喘組小鼠外周血中Foxp3+T細胞占CD4+T細胞比例顯著低于對照組，治療組Foxp3+T細胞比例與對照組水平無顯著差異；在BALF中，哮喘組Foxp3+T細胞比例低于對照組，而治療組BALF中的Foxp3+T細胞的比例顯著高于哮喘組，甚至高于對照組(表4)。

表2 小鼠外周血的IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ水平

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與哮喘組比較。

表3 小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ水平

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與哮喘組比較。

表4 小鼠外周血與BALF中CD4+T細胞中Foxp3+ T細胞比例的變化

*:P<0.01，與對照組比較；#:P<0.01，與哮喘組比較。

3 討 論

在本研究中，作者發現小青龍湯可以有效抑制卵蛋白誘導的肺部變應性炎癥，減少炎性細胞在肺部的募集，降低肺泡灌洗中Th2型細胞因子水平，升高調節性細胞因子IL-10的水平，并且誘導Foxp3+調節性T細胞產生。

調節性T細胞可以分為天然調節性T細胞(nature occurring regulatory T cells,nTregs)和誘導性調節性T細胞(inducible regulatory T cells,iTregs)，而IL-10是這兩種細胞發揮作用的重要介質。調節性T細胞數量減少及功能低下時對Th2偏移的調控減弱，是哮喘發生、發展的重要機制[5-7]；而哮喘的自然緩解也依賴于調節性T細胞的產生及IL-10的分泌[8]。作為治療哮喘的經典抗炎藥物，吸入性糖皮質激素也是通過誘導調節性T細胞的增加而發揮作用[9]。過敏原特異性免疫治療(脫敏療法)作為惟一有可能改變哮喘患者免疫反應并根治哮喘的方法，誘導調節性T細胞的產生及功能恢復，也是其作用機制之一[10]。而Mays等[11]的研究表明，在肺部通過外源性的方法使Foxp3表達增強，可以抑制變應原誘導的Th2型免疫反應。

小青龍湯已經應用于支氣管哮喘的治療，主要用于表寒里飲，寒象較重者。日本學者對本方在治療哮喘方面的作用非常重視，對其作用機制的研究極為深入。體外研究表明，小青龍湯能抑制組胺釋放和肥大細胞脫顆粒、Eos增殖、嗜堿性粒細胞的生長和分化、外周血單個核細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的合成，以及支氣管平滑肌收縮。動物模型表明，小青龍湯可以降低氣道高反應性[12]。進一步研究表明，小青龍湯降低了Th2細胞相關的細胞因子IL-4和IL-5的產生[13]；在OVA誘發的哮喘模型中，小青龍湯還使得OVA特異性IgE抗體水平下降[14]。

本研究發現，小青龍湯可以有效地抑制哮喘小鼠肺部變應性炎癥，降低Th2型細胞因子的分泌，還可以誘導調節性細胞因子IL-10的分泌增加，升高Foxp3+CD4+T細胞的比例，這與調節性T細胞及IL-10在哮喘發病機制中的重要作用相符。因此，作者推測，小青龍湯可能是通過誘導IL-10和Foxp3的表達，進而誘導分泌IL-10的Th1和表達Foxp3的Treg細胞產生，進而抑制變應原誘導的Th2型免疫反應。

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