AEG-1 siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞株增殖和凋亡影響的研究

秦瑞英，王宏偉，趙建華，楊玉新，劉 穎，任艷芳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.婦產(chǎn)科;2.感染疾病科;3.神經(jīng)內(nèi)科,河南衛(wèi)輝 453100)

宮頸癌是一種最常見的女性惡性腫瘤，在發(fā)展中國(guó)家，其發(fā)病率和病死率在女性腫瘤中居第2位，且發(fā)病率以每年2%～3%的速度增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著女性的健康[1]。手術(shù)、放療、化療等作為婦科惡性腫瘤治療的常規(guī)方法，對(duì)晚期患者療效不佳，且不良反應(yīng)多。小分子干擾RNA(short interfering RNA,siRNA)是1998年Fire等通過(guò)對(duì)線蟲的研究發(fā)現(xiàn)的一種RNA干擾技術(shù)，是目前醫(yī)學(xué)上用來(lái)研究基因功能和基因治療的最具潛力的工具之一[2]。自2002年Su等克隆出星形細(xì)胞上調(diào)基因1( astrocyte elevated gene-1,AEG-1)以來(lái)，該基因在腫瘤研究領(lǐng)域日益引起人們的重視。近年研究表明，AEG-1基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3]。因此本研究在體外通過(guò)脂質(zhì)體將AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞，研究AEG-1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為以AEG-1為靶點(diǎn)的宮頸癌基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌細(xì)胞株SiHa購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；AEG-1 siRNA和對(duì)照siRNA均購(gòu)自美國(guó)Zymed公司；總RNA提取試劑Trizol、RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞傳代到細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，以1×106cells/well細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，將AEG-1 siRNA和對(duì)照siRNA采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞(操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組(不作任何處理)、陰性對(duì)照組(對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染)和AEG-1 siRNA組(AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染)。

1.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的3組宮頸癌SiHa細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取采取Trizol一步提取法。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。AEG-1上游引物：5′-GGC AAT TGG GTA GAC GAA GA-3′，下游引物：5′-CCT GTT TTC GAC GGG TTT TA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用比較閾值法來(lái)測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組宮頸癌SiHa細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μL，培養(yǎng)1 d后細(xì)胞達(dá)到80%融合度。不同時(shí)間點(diǎn)(4、24、48、72 h)倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入含MTT溶液(5 g/L)10 μL的新鮮培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(490 nm)上調(diào)定各孔吸光度值，測(cè)定結(jié)果。以空白對(duì)照組調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組宮頸癌SiHa細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，250 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度為1×106cells/L。取100 μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，上機(jī)檢測(cè)(按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)。

1.6 細(xì)胞周期分析 收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組宮頸癌SiHa細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗細(xì)胞3次，4 ℃ 70%預(yù)冷乙醇固定30 min，預(yù)冷PBS漂洗3次，1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞于含1 mL PI的PBS溶液中，避光孵育30 min上機(jī)檢測(cè)，采用Modifit軟件分析細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌SiHa細(xì)胞AEG-1 mRNA表達(dá) 采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)宮頸癌SiHa細(xì)胞AEG-1 mRNA表達(dá)。結(jié)果表明：AEG-1 siRNA組AEG-1 mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組AEG-1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 AEG-1 mRNA相對(duì)表達(dá)分析

2.2 AEG-1 siRNA對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示：AEG-1 siRNA組SiHa細(xì)胞增殖較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯減慢。72 h時(shí)AEG-1 siRNA組SiHa細(xì)胞吸光度值與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組SiHa細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3 AEG-1 siRNA對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：AEG-1 siRNA組SiHa細(xì)胞凋亡率[(17.4±4.3)%]明顯高于空白對(duì)照組[(4.5±1.3)%]和陰性對(duì)照組[(5.2±1.8)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組SiHa細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 AEG-1 siRNA對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析SiHa細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示：AEG-1 siRNA組SiHa細(xì)胞在DNA合成前期(G0/G1期)細(xì)胞比率[(59.23±1.05)%]明顯高于空白對(duì)照組[(42.88±1.33)%]和陰性對(duì)照組[(43.13±0.88)%]，合成期(S)細(xì)胞比率[(26.46±0.87)%]顯著低于空白對(duì)照組[(32.59±1.19)%]和陰性對(duì)照組[(31.83±1.11)%]，合成后期(G2/M)細(xì)胞比率[(14.30±0.46)%]顯著低于空白對(duì)照組[(24.53±0.31)%]和陰性對(duì)照組[(25.03±0.68)%]，見圖4。

圖2 MTT法檢測(cè)AEG-1 siRNA對(duì)宮頸癌SiHa

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌SiHa凋亡率

圖4 AEG-1表達(dá)下調(diào)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響

3 討 論

宮頸癌是影響女性健康最重要的疾病之一，在年輕女性中的發(fā)病率近年有明顯的上升趨勢(shì)，日益引起人們的關(guān)注和重視。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)癌基因及抑癌基因的深入研究，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及治療的研究已進(jìn)入基因水平。RNA干擾( RNA interference，RNAi)是利用堿基互補(bǔ)原理，通過(guò)導(dǎo)入雙鏈RNA(double strands RNA，dsRNA)阻斷同源基因的表達(dá)促使其mRNA降解，從而誘導(dǎo)該細(xì)胞目的基因功能喪失或出現(xiàn)特定基因缺失的表型。RNAi作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有高效、特異、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[4]，是傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)和反義技術(shù)所無(wú)法比擬的。目前，RNAi對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療主要集中在腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(如癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因)，以及與腫瘤耐藥基因、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、有絲分裂有關(guān)的基因方面[5]。在體外培養(yǎng)細(xì)胞及建立的動(dòng)物模型中，利用RNAi技術(shù)治療腫瘤取得了令人滿意的效果。雖然目前RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床還有一定的距離，但有理由相信隨著對(duì)RNAi機(jī)制的深入研究和RNAi技術(shù)的不斷完善，腫瘤基因治療的目標(biāo)終究會(huì)實(shí)現(xiàn)。

AEG-1基因最初是在人類免疫缺陷病毒(HIV)-1感染的人胎兒星形細(xì)胞中被鑒定發(fā)現(xiàn)的[6]。2004～2005年，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后克隆出AEG-1 cDNA 序列，其全長(zhǎng)3 611 bp，含11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子，位于8q22，此區(qū)域是乳腺癌等多種癌癥高度相關(guān)地帶[7]。進(jìn)一步研究顯示，作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，AEG-1通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如PI3K-AKT、NF-κB、MAPK和Wnt等[8]，與腫瘤進(jìn)展的幾個(gè)關(guān)鍵方面，包括轉(zhuǎn)化、增殖、細(xì)胞的存活、逃避細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及耐藥等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)[9]。且被證實(shí)在多種腫瘤組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，如舌癌、前列腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、淋巴細(xì)胞癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌[10-15]等。

本實(shí)驗(yàn)用siRNA下調(diào)人宮頸癌細(xì)胞株中AEG-1基因表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)AEG-1基因下調(diào)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的影響，研究探討AEG-1在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。結(jié)果顯示通過(guò)下調(diào)AEG-1表達(dá)，可以顯著降低宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)，隨著AEG-1表達(dá)下降，宮頸癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，說(shuō)明AEG-1在宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中起了重要作用。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果也提示AEG-1表達(dá)下調(diào)后，更多的細(xì)胞阻滯在G0/G1期，處于增殖旺盛期的細(xì)胞比例明顯減少。研究結(jié)果提示AEG-1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起了重要作用，而利用RNA干擾技術(shù)可以下調(diào)AEG-1的異常高表達(dá)，在一定程度上阻滯宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能為宮頸癌的基因治療提供新的思路。

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