雷公藤多苷提取物中主要有效部位的含量比較*

何 昱 石森林 張茹萍 范永升 王新昌

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

雷公藤多苷是中藥雷公藤的去皮根經提取分離得到的活性組分混合物。雷公藤多苷的生理活性由二萜類、三萜類、生物堿類等多種成分協同產生［1］，但這些雷公藤多苷的有效成分也是其毒性成分［2-3］，引發了臨床上的眾多不良反應［4-5］。由于目前國內對雷公藤多苷提取物及制劑仍缺乏較為完善的質量控制標準，為進一步合理應用雷公藤多苷，本研究應用紫外可見分光光度法對不同廠家的雷公藤多苷提取物中總二萜、總三萜、總生物堿3個有效部位進行了含量測定，以期為臨床應用雷公藤多苷的安全有效提供實驗依據。

1 材 料

METTLER AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），UV-2450型紫外可見分光光度計 （島津，江蘇）；雷公藤甲素（中國藥品生物制品檢定所，批號111567-200502）、雷公藤紅素（貴州迪大科技有限責任公司，批號A0106）、雷公藤次堿（浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，批號201012），層析用中性氧化鋁（100-200目，上海五四化學試劑有限公司，批號100311），其他所用試劑均為分析純。雷公藤多苷提取物（西安天本生物工程有限公司，批號TBT111106、TBT110412、TBT110801、TBT110624、TBT111026、TBC111201、TBC110927；湖南協力藥業有限公司，批號20101209、20101108；桂林市三棱生物制品有限公司，批號 100808）。

2 方法與結果

2．1 總二萜的含量測定［6］

2．1．1 溶液制備 對照品溶液的制備：精密稱取雷公藤甲素對照品5．0mg，加甲醇溶解并定容于5mL的容量瓶中，得質量濃度為1．0mg/mL的對照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷提取物0．15 g，用無水乙醇溶解并稀釋至25mL容量瓶中，即得。

2．1．2 檢測波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各2．0mL，冰水浴中冷卻后加入2%3，5-二硝基苯甲酸溶液 2．0 mL和 2mol/L KOH溶液 2．0 mL，冰水浴中放置10min后，自來水沖淋2min。以無水乙醇加顯色劑為空白，在400～800 nm波長范圍內進行掃描，結果對照品與供試品在544 nm處均有最大吸收，故選擇544 nm作為雷公藤多苷樣品中總二萜的檢測波長（圖 1）。

圖1 雷公藤多苷中總二萜的可見吸收光譜圖

2．1．3 標準曲線的繪制 分別精密移取雷公藤甲素對照品溶液 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6mL 置于 10mL 容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，吸取5．0mL稀釋后的溶液于10mL容量瓶中，加入顯色劑，定容，在544 nm下測定吸光度。以質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，建立相應的回歸方程為 A=20．289C+0．129，r=0．9998。

2．1．4 精密度試驗 取質量濃度為 0．05mg/mL的雷公藤甲素對照品溶液，按“2．1．2 項”下方法顯色后，連續測定6次吸光度值，其RSD=0．36%。

2．1．5 穩定性試驗 批號20101209的雷公藤多苷樣品按“2．1．1項”下制備供試品溶液，顯色后每隔 5min測定吸光度值。結果35min內8次測得的吸光度RSD=2．88%，40min 內 9 次測得的 RSD=3．22%， 表明樣品溶液在顯色后35min內較為穩定，可以進行含量分析。

2．1．6 重復性試驗 平行制備6份批號20101209的雷公藤多苷供試品溶液，依法測定后計算含量，結果6份供試品溶液中總二萜含量的RSD=2．01%。

2．1．7 加樣回收率試驗 精密稱取 6份 0．075 g已知含量的雷公藤多苷樣品（批號20101209），分別加入相應量的雷公藤甲素對照品，按“2．1．2項”下方法制備樣品溶液，依法測定，計算得加樣回收率為 （100．48±2．41）%，RSD=2．40%。

2．1．8 樣品含量測定 各批次的雷公藤多苷提取物依法制備供試品溶液，顯色后在544 nm下測定吸光度值，計算其中總二萜的含量，結果如表1所示。

2．2 總三萜的含量測定［7-8］

2．2．1 溶液的制備 對照品溶液的制備 精密稱取雷公藤紅素對照品5．0mg，加甲醇溶解并定容于5mL容量瓶中，配制成質量濃度為1．0mg/mL的對照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷提取物0．1 g，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得。

表1 不同廠家雷公藤多苷提取物中3個有效部位含量（mg，s）

表1 不同廠家雷公藤多苷提取物中3個有效部位含量（mg，s）

廠家 n西安天本 4 4批號 總二萜 總三萜 總生物堿TBT110801 9．13±0．29 177．03±5．10 598．18±1．91 TBT110412 7．80±0．38 198．68±5．01 708．01±1．91 4 TBT111106 4．80±0．20 319．77±6．98 630．14±7．64 4 TBT110624 6．48±0．12 320．64±8．66 600．43±6．36 4 TBT111026 7．28±0．17 293．16±8．80 597．73±5．10 4 TBC111201 8．65±0．85 200．65±1．80 690．45±1．27 4 TBC110927 2．33±0．12 72．47±3．48 269．58±1．27湖南協力 4 20101209 10．79±0．14 210．91±5．39 338．48±8．27 4 20101108 9．34±0．058 226．35±5．18 521．22±3．82桂林三祾 4 100808 4．43±0．14 233．64±6．33 765．17±8．92

2．2．2 檢測波長的選擇 分別精密移取對照品溶液和供試品溶液各 0．02mL，100℃水浴揮干， 加入 0．4mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1．0mL高氯酸，搖勻后70℃水浴中加熱45min，自來水冷卻5min后再加入5．0mL冰醋酸，搖勻，10 min后，以冰醋酸為空白，在 400～600 nm波長范圍內進行掃描，結果對照品溶液與供試品溶液在541 nm處均呈現最大吸收，在此波長下，顯色劑對測定沒有干擾（圖2）。

圖2 雷公藤多苷中總三萜的可見吸收光譜圖

2．2．3 線性關系考察 精密移取雷公藤紅素對照品溶液 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6mL， 用甲醇稀釋并定容于10mL 容量瓶中。再精密移取 2．5mL，按“2．2．2 項下”顯色后測定541 nm處的吸光度值。以質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得回歸方程A=25．183C+0．129，r=0．9998。

2．2．4 精密度試驗 取1．0mg/mL的雷公藤紅素對照品溶液，顯色后連續測定6次吸光度值，其RSD=0．30%。

2．2．5 穩定性試驗 取批號 TBT111026的雷公藤多苷供試品溶液在顯色后1 h內測定吸光度。結果40min內7次測定的吸光度值RSD=2．48%，50min內8次測定的RSD=3．22%，表明在顯色后40min內樣品穩定。

2．2．6 重復性試驗 取批號TBT111026的雷公藤多苷提取物，按“2．2．1項”下方法平行制備6份供試品溶液，依法測定，按標準曲線計算含量，結果6份供試品溶液中總三萜含量的RSD=1．92%。

2．2．7 加樣回收率試驗 取6份0．05g已知含量的雷公藤多苷樣品（批號TBT111026），分別加入相應量的雷公藤紅素對照品，按“2．2．1項”下制備供試品溶液，依法顯色后測定， 得加樣回收率為 （99．30±2．39）%，RSD=2．41%。

2．2．8 樣品含量測定 各批次的雷公藤多苷提取物樣品依法顯色后在541 nm下測定吸光度，計算所得量減去總二萜的含量即為雷公藤多苷提取物中總三萜的含量，結果如表1所示。

2．3 總生物堿的含量測定［9］

2．3．1 溶液制備 對照品溶液的制備：精密稱取雷公藤次堿對照品5．0mg，加乙腈溶解并定容于5mL容量瓶中，配制成濃度為1．0mg/mL的對照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取雷公藤多苷樣品0．15 g，置25 mL容量瓶中，加氯仿溶解并定容。精密移取2．0mL溶液，上3．5 g的中性氧化鋁層析柱，以60mL氯仿∶甲醇（97∶3）洗脫，洗脫液水浴揮干，殘渣用甲醇復溶后定容至50mL的容量瓶中。

2．3．2 檢測波長的選擇 分別將對照品溶液和供試品溶液在200～800 nm波長范圍內進行掃描，結果對照品與供試品在225 nm、267 nm處均有最大吸收（圖3）。為避免225 nm處雷公藤二萜類及三萜類的較強吸收干擾，故最終選擇267 nm作為總生物堿的測定波長。

圖3 雷公藤多苷中總生物堿的紫外吸收光譜圖

2．3．3 線性關系考察 精密吸取雷公藤次堿對照品溶液 0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0mL 置 10mL 容量瓶， 用甲醇稀釋后定容，測定267 nm處吸光度。以質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，計算得回歸方程A=4．629C+0．0305，r=0．9996。

2．3．4 精密度試驗 取質量濃度為 0．05mg/mL的雷公藤次堿對照品溶液，連續測定6次吸光度，其RSD=0．041%。

2．3．5 穩定性試驗 取批號20101108的雷公藤多苷供試品溶液， 分別于制備好后的 0、2、4、6、8、10、24 h，測定267 nm處的吸光度，結果24 h內RSD為0．23%，表明供試液在制備后24 h內穩定性良好。

2．3．6 重復性實驗 取批號20101108的雷公藤多苷6 份，按“2．3．1 項”下方法平行制備 6 份供試品溶液，依法測定，計算得含量的RSD=2．19%。

2．3．7 加樣回收率試驗 取 6份 0．075g已知含量的雷公藤多苷提取物（批號20101108），分別加入相應量的雷公藤次堿對照品，依法測定，按標準曲線計算含量，得加樣回收率為（100．32±2．22）%，RSD=2．21%。

2．3．8 樣品含量測定 各批次的雷公藤多苷提取物按“2．3．1 項”下制備供試品溶液，依法測定，根據回歸方程計算得雷公藤多苷提取物中總生物堿的含量，如表1所示。

3 討 論

3．1 檢測指標的確定 課題組在以往研究中已對雷公藤多苷提取物中的雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤內酯甲等單體組分進行了HPLC含量測定［10］。但是，雷公藤多苷中眾多的化學成分均有生物活性和毒性的報道，光憑單一成分并不能完全代表其藥效、毒性等作用［11］，因此本研究應用紫外可見分光光度法對雷公藤多苷中總二萜、總三萜及總生物堿3個有效部位進行了含量測定，以更全面地反映雷公藤多苷的化學組成情況。

3．2 定量結果的比較 從各批次雷公藤多苷提取物的測定結果來看，3個有效部位中，總二萜的含量最低，其次為總三萜，總生物堿的含量最高。同時，在3個廠家的各批次樣品間，有效部位的最高含量與最低含量之間分別相差 4．6 倍、4．4 倍和 2．6 倍。雷公藤多苷作為治療指數較小的藥物［12］，其組成成分含量上的顯著差異值得引起相關生產廠家的重視。

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