TNF-α-308基因多態性與強迫癥的易感性研究

高玉峰 ，邱海棠 ，王 帆，張向陽，傅一笑，羅慶華，杜 蓮，邱 田，蒙華慶△

(1.廣東省中山市第三人民醫院二科 528451；2．重慶醫科大學附屬第一醫院心理衛生中心 400016；3．北京回龍觀醫院中心實驗室 100096)

強迫癥(obsessive-compulsive disorder，OCD)是以強迫觀念，強迫意向，強迫行為為主要臨床表現的神經癥。普通人群患病率1.1%～3.3%。OCD的病因至今未明，但已有研究顯示強迫癥具有家族遺傳聚集性，患者家屬中OCD及亞臨床OCD患病率較普通人群高10%～20%[1]。5-HT類基因是OCD的候選基因，然而已有的研究顯示5-HT對OCD易感性的影響結論不一，使得研究人員不得不進一步尋找除此之外的其他影響因素[2-3]。Marazziti等[4]研究發現，OCD患者較健康人CD8(TS細胞)明顯增多，CD4(Th細胞)明顯減少。Barber等[5]研究也發現，男性OCD患者的自然殺傷(NK)細胞升高，都提示OCD患者的免疫系統也發生了改變。編碼人腫瘤壞死因子α(TNF-α)的基因定位于6號染色體短臂上，位于MHC-Ⅲ區，現已發現有高度的基因多態性。其多態性表現為兩個不同的等位基因形式：將-308位是鳥嘌呤(G)的等位基因定義為常見型TNF1/1，為腺嘌呤(A)時定義為稀少型TNF2，即TNF-308位G被A替換，形成TNF2等位基因形式(包括TNF2/2和TNF1/2)[6]。研究表明，TNF2可以提高TNF-α轉錄活性而增加TNF-α的產生[7]。多項研究都顯示，TNF2等位基因與一系列感染性疾病及自身免疫性疾病有關[8-9]。本研究通過比較分析TNF-α-308基因型在OCD組及健康對照組中的分布，探討其基因多態性與OCD易感性的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2008年2月至2008年6月重慶醫科大學附屬第一醫院精神科門診就診及北京回龍觀醫院住院的26例OCD患者(OCD組)。其中男12例，平均(32.12±5.39)歲，起病年齡(18.27±4.94)歲，平均病程(5.32±1.74)年；女14例，平均(30.29±6.36)歲，起病年齡(19.36±5.19)歲，平均病程(6.4±2.95)年。入組標準：(1)符合中國精神障礙分類與診斷標準第3版(CCMD-3)中OCD的診斷標準；(2)無器質性疾病；(3)年齡在18～65歲；(4)均為漢族。收集重慶醫科大學附屬第一醫院體檢中心的14例健康體檢人員及志愿者(健康對照組)。其中，男7例，平均(30.27±5.78)歲；女7例，平均(34.29±7.29)歲。入組標準：年齡18～65歲；無重大軀體疾病，無任何符合診斷標準的精神疾病；既往無精神疾病史，無精神疾病家族史，所有研究對象均無血緣關系。

1.2方法

1.2.1標本收集 抽取肘靜脈血2 mL置于含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的試管中，輕輕搖勻后置于-20 ℃冰箱保存備測。

1.2.2DNA提取 采用Promega生物工程有限公司基因組DNA提取試劑盒，參照說明書步驟進行。

1.2.3PCR擴增 TNF-α基因啟動子-308位點引物(引物由北京生工合成)FW：5-′GAG GCA ATA GGT TTT GAG GGC CAT;RV:GGG ACA CAC AAG CAT CAA G-3′，擴增產物長度為147 bp。PCR反應體系:總體積10 μL,含引物(各5 pmol/μL)0.6 μL,10×PCR緩沖液1 μL,DNA(模板)2 μL，taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(d NTP) 0.2 μL，三蒸水5.2 μL。采用熱循環儀，95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s,59 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次；最后72 ℃ 5 min末次延伸。

1.2.4酶切及電泳 酶切體系總體積10 μL，含PCR擴增產物9 μL，10×緩沖液0.7 μL,限制性內切酶NcoⅠ 0.3 μL(10 U/μL,購至MBI公司)，37 ℃過夜。將產物上樣于3%瓊脂糖膠，與標準DNA Maker同步電泳，恒定電壓120 V電泳50 min后分析結果。酶切后產生3種結果147 bp,147 bp 126 bp 21 bp,126 bp 21 bp,分別代表TNF-α1/1型(終產物為126 bp 1條帶，G等位基因純合子)； TNF-α1/2(終產物為147 bp、126 bp兩條帶，雜合子)，TNF-α2/2(終產物為147 bp 1條帶，A等位基因純合子)。由于21 bp的條帶長度太小，在凝膠上無法分辨，故能夠觀測到的是147 bp和126 bp兩個條帶。

1.3統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件進行分析，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。將TNF-α-308基因型等位基因TNF-α1/1及1/2型以四格表進行χ2檢驗，計算比值比(OR)和95%CI，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PCR質量控制結果 隨機抽取5例樣本，重復檢測基因型結果與前完全一致，證明本試驗結果可靠。

2.2TNF-α-308位基因多態性PCR結果 其中1泳道為TNF1純和基因型；2泳道為TNF2純和基因型；5泳道為TNF1/2雜合型，見圖1。

1、2、4：TNF-α1/1純合基因型；3：DNA Marker；5：TNF-α1/2雜合基因型。

圖1 TNF-α基因啟動子-308位點3%瓊脂糖膠電泳圖

2.3兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗 OCD組TNF-α基因型分布的觀察值和期望值吻合度良好，差異無統計學意義(P>0.05)；健康對照組TNF-α基因型分布的觀察值和期望值吻合度良好；均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。

2.4OCD和健康人TNF-α基因檢測結果 本實驗結果TNF-α基因啟動子區域-308位點只發現TNF-α1/1型及TNF-α1/2型兩種基因型，未發現TNF-α2/2基因型。TNF的基因型在OCD組及健康對照組中分布均以1/1型純合子占優勢，OCD組為16.7%(TNF1/2)和83.3%(TNF1/1)，而健康人中全為TNF1/1型。兩組之間的基因型頻率分布的比較，差異有統計學意義(χ2=15.73，P<0.01)。

2.5兩組TNF-α-308 位基因多態性與OCD的相關分析 OCD組與健康對照組的差異主要來自G等位基因，差異有統計學意義(P<0.01)，使其患OCD的危險性提高了1.93倍。因此，等位基因G與OCD易感性存在正相關。

3 討 論

已有許多研究提示，免疫系統在包括抑郁、癡呆、精神分裂癥等精神疾病的發生、發展中所起的作用，一些焦慮的疾病包括創傷后應激障礙、驚恐障礙、社交恐懼和OCD患者[10-11]。人們很早就注意到免疫系統在精神疾病中的病理生理作用。近年來的研究表明，細胞因子特別是TNF-α參與了急、慢性神經退行性變，并且與神經遞質尤其是兒茶酚胺系統的平衡有相互作用。TNF-α是具有多種生物學效應的一種細胞因子，不僅對腫瘤細胞有細胞毒、細胞溶解、抑制增殖等作用，還影響多種正常細胞的生長分化。另外，TNF-α還是一種重要的炎性介質，參與免疫病理反應，在機體免疫-炎癥協調的信號網絡調節中起重要作用，還通過迷走神經對中樞產生直接和間接的影響[12]。

人類細胞因子基因多態性數據庫已報道了其啟動子區的8個單核苷酸多態性(SNP)位點，且一些SNP位點的等位基因與某些感染性和自身免疫性疾病相關[13]。TNF-α基因啟動子區域多態性分布是非隨機性的，而很可能與選擇性的功能表達相關[14]。有研究首先報道了TNF-α基因啟動子區域內-308位點的雙等位基因多態性， -308位點的G-A突變在高加索人種中出現頻率高，較早就已成為研究熱點[15-16]。Louis等[6]發現，用脂多糖刺激TNF-α-308-2等位基因攜帶者個體的血細胞與TNF-α-2等位基因相比較，能產生較多量的TNF-α，表明TNF-α-308-2等位基因攜帶者由于TNF-α誘導表達水平增高，可能增加相關疾病的易感性。雖然TNF-α對疾病具有重要意義，但-308位點G-A突變發生率相當低。據報道，在新西蘭，健康人群TNF-α基因該位點突變率發生率為5.3%[17]。筆者采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性(PCR-RFLP)法對TNF-α基因多態性進行分析發現，在OCD患者中點突變的發生率為16.7%，健康人中沒有發現點突變，可能與樣本量較小有關。OCD組TNF-α點突變顯著高于對照組，結果與Konuk等[18]的研究相似。而Monteleone等[19]的研究發現，在血漿IL-1β及IL-6的水平與健康對照組都沒有發現顯著性差異，而OCD患者的TNF-α水平顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(P=0.001)。

綜上所述，TNF-α等位基因可能與OCD的易感性相關， TNF-α的功能為基因頻率在臨床上可作為遺傳性標記進行檢測，對于預防早期OCD的發展具有重要意義。但本研究沒有考慮其他細胞因子的多態性位點及其他危險因素的影響，不能排除TNF-α-308位點與其他細胞因子的位點基因連鎖而成為OCD易感性相關的遺傳標志，還有待于擴大樣本進行多因素分析。

[1]Jonnal AH,Gardner CO,Prescott CA,et al.Obsessive and compulsive symptoms in a general population sample of female twins[J].Am J Med Genet,2000,96(6):791-796.

[2]Cavallini MC,Di Bella D,Siliprandi F,et al.Exploratory factor analysis of obsessive-compulsive patients and association with 5-HTLPR polymorphism[J].Am J Med Genet,2002,114(30):347-353.

[3]Di Bella D,Erzegovesi S,Cavallini MC,et al.Obsseive- Compulsive Disorder,5-HT polymorphism and treatment response[J].Pharmacogenomics,2002,2:176-181.

[4]Marazziti D,Presta S,Pfanner C,et al.Immunological alternation in adult obsessive-compulsive disorder[J].Biol Psychiatry,1999,46(6):810-814.

[5]Barber Y,Toren P,Achiron A,et al.T cell subsets in obsessive-compulsive disorder[J].Neuropsychobiology,1996,34(2):63-66.

[6]Louis E,Franchimont D,Piron A,et al.Tumor necrosis factor gene polymorphism influences TNF alpha production in LPS-stimulated whole blood cell culture in healthy humans[J].Clin Exp Immunol,1998,113(3):401-406.

[7]Harcos P,Laki J,Kiszel P.Decreased frequency of the TNF2 allele of TNF-alpha-308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction[J].Cytokine,2006,33(2):100-105.

[8]Perera MK,Herath NP,Pathirana SL,et al.Association of high plasma TNF-alpha levels and TNF-alpha/IL-10 ratios with TNF2 allele in severe P.falciparum malaria patients in Sri Lanka[J].Pathog Glob Health,2013,107(1):21-29.

[9]Charli-Joseph Y,Cruz-Fuentes C,Orozco-Topete R.Incidence of adverse cutaneous drug reactions in a Mexican sample:an exploratory study on their association to tumour necrosis factor alpha TNF2 allele[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2009,23(7):788-792.

[10]Leonard BE,Myint A.Changes in the immune system in depression and dementia:causal or coincidental effects?[J].Dialogues Clin Neurosci,2006,8(2):163-174.

[11]Hinze-Selch D,Pollmacher T.in vitro cytokine secretion in individuals with schizophrenia:results,confounding factors,and implications for further research[J].Brain Behav Immun,2001,15(4):282-318.

[12]Prasad R,Kapoor R,Srivastava R,et al.Cerebrospinal fluid TNF-α,IL-6,and IL-8 in children with bacterial meningitis[J].Pediatr Neurol,2013,8(16):1.

[13]Haukim N,Bidwell JL,Smith AJ,et al.Cytokine gene polymorphism in human disease:on-line databasese,supplement[J].Genes Immun,2002,3(6):313-330.

[14]郭芮兵，陳仕林.TNF-α基因多態性對TNF-α產物的影響及其與疾病的關系[J].醫學研究生學報，2003，16(5)：382-385.

[15]Auguet T,Vidal F,López-Dupla M,et al.A study on the TNF-alpha system in Caucasian Spanish patients with alcoholic liver disease[J].Drug Alcohol Depend,2008,92(1/3):91-99.

[16]Hong J,Leung E,Fraser AG,et al.IL4,IL10,IL16,and TNF polymorphisms in New Zealand Caucasian Crohn′s disease patients[J].Int J Colorectal Dis,2008,23(3):335-337.

[17]Noronha IL,Niemir Z,Stein H,et al.Cytokines and growth factors in renal disease[J].Nephrol Dial Trans-plant,1995,10(6)：775-786.

[18]Konuk N,Tekin IO,Ozturk U,et al.Plasma levels of tumor necrosis factor-alpla and interleukin-6 in obsessive compulsive disorder[J].Mediators Inflamm,2007，2007:65704.

[19]Monteleone P,Catapano F,Fabrazzo M,et al.Decreased blood levels of tumor necrosis fctor-alpha patients with obsessive-complusive disorder[J].Neuropsychobiology,1998,37(4):182-185.