OPN 影響小鼠MSCs 遷移及其相關分子機制研究*

李 薇,王文平,陳 亮,王珍祥,李世榮

(第三軍醫大學附屬西南醫院整形外科,重慶 400038)

骨髓間充質干細胞(MSCs)向受損組織的定向遷移已經成為 MSCs 研究的關鍵問題，但相應的機制仍不十分清楚[1-3]。同時，機體受損部位MSCs被募集時，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達上調，有可能通過誘導MSCs 定向遷移參與組織修復[4-6]。但迄今為止，OPN 與 MSCs 遷移方面的研究甚少[7]，因此本研究擬通過應用外源OPN，觀察其對 MSCs 遷移能力的影響，探索 OPN 不同受體在 MSCs 遷移過程中的作用，闡明 OPN 影響 MSCs 遷移行為的機制，為促進創傷愈合尋求新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料 重組小鼠OPN，美國Gibco公司；標準胎牛血清(FBS)，蘭州明海公司；Transwell系統，孔徑為8 μm、膜直徑為6.4 mm，美國BD公司；改良伊格爾(DMEM/F-12)培養液，美國HyClone公司；鼠抗OPN單克隆抗體、鼠抗CD44 單克隆抗體，美國Santa Cruze公司；鼠抗Integrin β1 單克隆抗體，Cell Signaling Technolog；GHPDH蛋白 Marker，北京中衫公司；瓊脂糖凝膠電泳系統，美國Bio-Rad公司；PE標記小鼠抗大鼠 CD34、CD105抗體，美國Santa Cruze公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組 OPN-/-小鼠來自美國Jackson實驗室；野生型C57小鼠來自第三軍醫大學大坪醫院SPF級動物室。細胞體外實驗分為4組：(1)無細胞培養液為空白對照組；(2)OPN-/-小鼠MSCs為蛋白表達陰性組；(3)OPN治療組，在OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN，達到0.5 μg/mL的濃度培養MSCs；(4)野生型C57小鼠MSCs為OPN陽性組。以上實驗每組設 3個樣本，每個實驗重復3次。

1.2.2胎鼠原代MSCs培養 取孕19 d雌鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min。無菌鑷子及剪刀配合取出胎鼠，置于裝有冷磷酸鹽緩沖液(PBS)的玻璃皿內。剪下胎鼠四肢，輕柔仔細取出胎鼠長骨周圍軟組織，剃出長骨至新的培養皿中，盡量剪碎骨組織加入裝有培養液DMEM/F-12+10% FBS的玻璃平皿內，吸管吹散，經300目濾網過濾后，濾液轉移至離心管內，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。DMEM/F-12+10% FBS培養基重懸細胞。于37 ℃，5% CO2培養箱內培養。培養24 h后可見細胞貼壁，進行換液。細胞融合至80%視野時進行傳代。

1.2.3流式細胞儀分選培養細胞 胎鼠MSCs經傳代后鏡下見雜細胞逐漸增多，傳至P3，行流式分選以純化。方法如下：所有胎鼠MSCs用PBS洗兩遍，胰酶消化，鏡下控制反應時間，待細胞變圓從瓶壁脫落終止消化，轉移至離心管內1 000 r/min離心 10 min，棄上清液。PBS重懸細胞，1 000 r/min離心 10 min，棄上清液。PBS重懸，計數板計數，得細胞數4×105個，分A、B、C、D 4個EP管，每管1×105。A管內不加抗體，B管內加入2.5 μL CD105 PE抗體，C管內加入2.0 μL CD34 FITC抗體，D管內加入2.5 μL CD105 PE及2.0 μL CD34 FITC抗體。4 ℃孵育1 h，不時混勻，1 000 r/min離心 10 min。于冰盒內送至西南醫院癌癥中心進行流式分選。

1.2.4Transwell 檢測細胞遷移 取P3的MSCs，處理 24 h以后，酶消化并計數。細胞懸液離心，去除完全培養基，PBS清洗2次。加入培養基，使細胞密度為2×103μL-1。 將2×105細胞懸液加入Transwell小室的上室中， 在下室中加入600 μL的F12-DMEM培養基和OPN混合均勻，使OPN終濃度為0.5 μg/mL，靜置6 h； 其后在孵育12、24、36 h，取出Transwell小室，擦去小室膜上面的未遷移的細胞，倒置風干；再在每孔中加入500 μL 0.1%結晶紫溶液，將小室置于其中，同時使膜完全浸沒在結晶紫溶液中。室溫 30 min 后將小室取出，PBS 清洗，風干； 最后將小室的膜面正置于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察。選取4個視野計數，得到遷移細胞數的平均值。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 參考文獻[7],取第3代MSCs，加入F12-DMEM培養基和相應的外源重組OPN，使得細胞融合度達到70%～80%終止培養，收獲細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，上樣量40 μg，電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗OPN(1∶500)、CD44(1∶800)、 Integrin β1(1∶1 000) ，4 ℃孵育過夜。洗膜，分別加HRP 標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000)，繼續孵育2 h，加ECL發光液，X射線曝光顯影。GAPDH為內參照，數據用SensiAnsys 軟件分析。

2 結 果

2.1MSCs 的形態學觀察 剛轉移的細胞呈圓形，不均勻懸浮于培養液中。24 h 后細胞可見貼壁，大部分呈圓形。72 h后，細胞開始呈短梭形纖維狀、三角形或星形。未貼壁的雜細胞容易被除去。6 d左右，細胞集落放射狀排列，并在14 d左右時細胞達到 85%融合。傳代后細胞24 h內呈纖維狀完全伸展。 傳代細胞4～6 d超過80%融合，呈現更強的增殖能力，形成細胞形態趨于一致的漩渦樣單層。

A:小鼠MSCs遷移數量最多；B:0.5 μg/mL的OPN能顯著增加OPN-/-MSCs的遷移細胞數；C：OPN-/-MSCs遷移極少；組標1、2、3：觀察時間12、24、36 h。

圖1 OPN影響MSCs遷移

2.2流式細胞儀分選培養MSCs 結果 MSCs 對CD90、CD105、CD29、CD44等表面標記抗原呈陽性，而對CD34、CD35 CD14等造血干細胞表面標記抗原呈陰性反應。本實驗結果表明，CD34 呈陰性(1.02%)，CD44呈陽性(96.10%)，CD105 呈陽性(95.30%)，細胞純化度較高。分離得到的細胞表達 CD44 和 CD105，但不表達 CD34，符合 MSCs 表面標記抗原的一般規律。

2.3OPN 促MSCs 定向遷移 與空白對照組相比，OPN治療組能增加體外MSCs的細胞遷移，而OPN陽性組MSCs遷移為最多。同時，這一趨勢與OPN作用時間正相關，培養36 h細胞遷移數多于24 h，而24 h又多于12 h(圖1)。 進一步，以OPN作用時間36 h細胞遷移數作統計分析，OPN陽性組能使MSCs 的遷移細胞數增加 2倍以上(圖2)，而OPN治療組能顯著增加MSCs的遷移細胞數，也超過了1倍，與OPN陰性組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。再以MTT 法檢測在遷移過程中活細胞的數目，結果表明不同濃度的 OPN 均不會使MSCs細胞數明顯改變。

2.4外源性重組OPN 可以促進MSCs細胞中OPN蛋白表達 將OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN(達到0.5 μg/mL的濃度)，孵育36 h通過Western blot檢測OPN-/-與野生型C57小鼠MSCs OPN表達發現，若以OPN陰性組為基數100，OPN治療組蛋白量明顯增加，但仍低于OPN陽性組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 OPN影響MSCs遷移比率變化比較

圖3 Western blot檢測加入外源性OPN后MSCs中OPN蛋白表達變化

圖4 Western blot檢測OPN影響MSCs相關蛋白表達變化的比較

2.5OPN促進MSCs細胞中Integrin β1 和 CD44蛋白表達 在孵育36 h通過Western blot檢測各組MSCs OPN表達發現，若以OPN陰性組為基數100，OPN治療組CD44蛋白表達增多，定量分析增加明顯，但OPN陽性組細胞CD44蛋白表達進一步增多，定量分析增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。同樣的結果，若以OPN陰性組為基數100，OPN治療組Integrin β1蛋白表達增多，差異明顯，而OPN陽性組細胞Integrin β1蛋白表達最多，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

3 討 論

MSCs 具有很強的體外增殖能力，并同時保持多向分化潛能，因此可作為組織修復的種子細胞，也是多種修復細胞的來源，在損傷愈合中具有重要而關鍵的作用，但許多有關MSCs的作用環節仍然不甚清楚，需要進一步研究[8-9]。本實驗中，骨髓提取細胞增殖能力強，細胞形態與MSCs一致。流式細胞儀檢測表明CD34 呈陰性，CD44、CD105 呈陽性，細胞純化度超過90%。因此，使用適量的骨髓便可獲得足量的 MSCs。

OPN 可以介導多種細胞的黏附與遷移[10]。OPN 的缺失降低機體損傷修復功能。缺氧條件下，受損部位 OPN 表達上升，同時誘導MSCs遷移至受損部位，參與組織修復[7]。但OPN 在 MSCs定向遷移過程中的作用與調節機制仍未引起重視。 本研究將OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN(達到0.5 μg/mL)，孵育36 h通過Western blot檢測OPN-/-小鼠與野生型C57小鼠MSC細胞OPN表達發現，在OPN-/-小鼠加入重組OPN，細胞OPN蛋白表達量明顯增加，但仍低于野生型C57小鼠。分析結果證實，OPN 能夠誘導MSCs 定向遷移。0.5 μg/mL的OPN能增加體外MSCs的細胞遷移，而野生型C57小鼠MSC細胞遷移為最多。同時，這一趨勢與OPN作用時間呈正相關，與OPN-/-小鼠相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。OPN 促進MSCs 定向遷移的分子機制還有待進一步探索。

CD44是另一種 OPN 細胞表面受體，可以介導 OPN 促細胞遷移，阻斷 CD44 能夠抑制OPN 促MSCs遷移[11]。本研究發現， 0.5 μg/mL重組OPN促進CD44蛋白表達增多，定量分析增加非常明顯，但野生型C57小鼠細胞CD44蛋白表達進一步增多，相互比較CD44蛋白增加最為顯著。結果表明，OPN 能夠增加MSCs 中CD44的表達，同時通過結合細胞表面Integrin β1 受體，促進MSCs 定向遷移。

Integrin β1 直接參與調節細胞遷移和組織重構。而OPN 促MSCs 遷移的同時，是否改變了Integrin β1 的表達情況值得研究[12]。本研究也發現，OPN 可以增加Integrin β1 的表達量。OPN作用與時間呈正相關，OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN孵育時間越長，Integrin β1 的蛋白就越高。 MSCs 可能通過Integrin β1，從而定向遷移至缺血性心肌組織中[13]。一旦阻斷Integrin β1 后，OPN 促MSCs 遷移過程受到抑制，表明Integrin β1參與 OPN促MSCs定向遷移。

綜上所述，OPN 具有促MSCs 定向遷移的能力，且其作用與 OPN 濃度以及作用時間有關。同時，OPN 提高CD44、Integrin β1 受體的蛋白表達水平， 如果阻斷后兩者受體，OPN 促MSCs 定向遷移的能力受到抑制。因此， OPN可能通過上調MSCs 中CD44、Integrin β1 受體的表達，促進MSCs遷移。

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