趨化因子10在慢性非萎縮性胃炎、胃癌癌前病變及胃癌中的表達及意義*

何 甜，唐 慧，郭 強△，楊 慧

(云南省第一人民醫院：1.消化內科；2.基礎醫學研究所/云南省重點實驗室；3.病理科，昆明 650032)

胃癌(GC)是消化道常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來世界范圍內GC總體發病率呈下降趨勢，但其發病率和病死率在各類惡性腫瘤中均居首位，嚴重威脅著人民的身體健康。目前，尋找特異性的治療靶點，成為GC治療研究中心的一個熱點。而隨著腫瘤與分子學關系研究的不斷深入，其中趨化因子10(CXCL10)與其受體CXCR3構成的生物學軸成為目前研究熱點。近年來的研究發現，眾多腫瘤細胞均可過度表達CXCL10，其可能對腫瘤的生物學行為起到重要的調控作用，包括誘導細胞凋亡，促進細胞增殖炎癥效應等[1-2]，但關于CXCL10與GC的研究鮮見報道。而眾所周知，GC癌變的發展演變過程是從慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophy gastritis,CNAG)→慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)→腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)→不典型增生(dysplasia,Dys)→GC，其中CAG→IM→Dys作為GC發生、發展的重要階段，被統稱為癌前病變(precancerous lesions，PL)[3]。本研究采用SP免疫組織化學法檢測CXCL10蛋白在GC PL組織中的表達變化，以期進一步揭示GC癌變的發生、發展機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2006年6月至2009年12月140例樣本，其中CNAG 20例、PL 60例(CAG伴IM 20例、CAG伴輕-中度Dys 20例、CAG伴重度Dys 20例)；GC 60例(高分化GC 20例、中低分化40例)。20例CNAG，男9例、女11例，平均(51.1±14.9)歲；60例PL，男46例、女14例，平均(55.9±22.1)歲；60例GC，男42例、女18例，平均(60.6±26.4)歲。所有病例術前均無化療、放療及免疫治療史。本研究獲得了本院倫理委員會的批準及患者的知情同意。全部研究樣本均經病理組織學證實，GC分類參照日本胃癌學會標準[4]。判斷標準：CNAG，發現水腫，線狀充血，紅斑，并經胃黏膜活檢證實黏膜表層上皮細胞變性或壞死脫落形成糜爛，固膜有淋巴細胞及漿細胞浸潤；CAG，內鏡檢查發現有明顯的柱狀上皮化生和皺襞肥厚，并經胃黏膜活檢證實有杯狀細胞存在和腺體細胞增生肥大；GC，手術切除樣本中，取無壞死的癌組織，經常規病理切片證實為GC。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學SP法檢測CXCL10蛋白的表達 CXCL10抗體購自Abcam公司，檸檬酸型抗原修復緩沖液(pH6.0，MVS-0100)、超敏SP試劑盒(KIT-9710)、DAB試劑盒(DAB-0031)、蘇木素體細胞快速染色液(CTS-1099)、磷酸鹽緩沖液(PBS-0061)和中性樹膠(DAB-0033)均購自福州邁新生物技術公司。

標本采用40 g/L 甲醛固定，石蠟包埋，免疫組織化學采用SP法。切片厚度4 μm，置于載玻片上；常規脫蠟，不同濃度的乙醇中脫水至水洗；30 mL/L過氧化氫甲醇溶液室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；山羊血清室溫下孵育20 min；檸檬酸型抗原修復緩沖液(pH 6.0)微波修復；PBS洗后滴加一抗(工作濃度為1∶500)50 μL，濕盒內4 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加SP試劑盒中生物素標記的二抗，置37 ℃ 30 min，PBS沖洗；滴加鏈霉親和素辣根過氧化物酶50 μL，置37 ℃ 30 min，PBS沖洗；DAB室溫下顯色；PBS終止顯色；清水沖洗10 min后蘇木素復染、脫水、透明、封片、照相。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2圖像采集和結果判讀 切片用Olympus BX 50光學顯微鏡觀察、攝像。用HMIAS-2000高清晰度全自動彩色圖像分析系統(武漢千屏影像技術有限責任公司)采集圖像并對各CXCL10蛋白表達的陽性染色面積及染色強度進行分析。每張切片隨機選擇10個視野取平均值。結果判讀采用雙盲法，并由兩位病理醫師獨立讀片評定CXCL10蛋白染色結果，評估參考文獻[5]及預實驗結果采用綜合評分法，根據染色強度及著色面積進行判斷。染色強度：0分，無顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。在400倍光鏡下隨機觀察5個不同的視野，按顯色細胞比例評分，0分：<5%；1分：5%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。根據以上兩項指標得分的和作為判斷表達結果，若積分小于或等于1為陰性，2～4為弱陽性，5～7為強陽性。

2 結 果

2.1CXCL10蛋白在CNAG、PL和GC中的表達結果 CXCL10蛋白在這些胃黏膜組織中均有表達，表達部位集中在細胞膜及細胞質中。在CNAG、PL和GC中CXCL10蛋白的表達陽性率分別為：10%(2/20)、26.67%(16/60)、71.67%(43/60)；且CXCL10蛋白在CNAG、PL和GC中表達多為淡黃色顆粒(圖1)，隨著CNAG-PL-GC演進過程中，CXCL10蛋白陽性表達率逐漸升高，表達面積逐漸增大。

A：CAG；B：CAG伴IM；C：CAG伴Dys；D：GC。

圖1 CXCL10蛋白在CNAG 、PL和GC中的表達情況(蘇木素復染×400)

2.2CXCL10蛋白在不同病理類型中的表達陽性率的比較 χ2檢驗發現，CXCL10蛋白陽性表達率在GC組中異常升高，極顯著高于CNAG及PL組，差異有統計學意義(P<0.01)；而CXCL10蛋白在PL、CNAG兩種病理組織中陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3CXCL10蛋白表達與PL、 GC患者各臨床病理特征的關系 將PL分為CAG伴IM及CAG伴Dys， CXCL10蛋白在兩種病理組織中陽性表達率分別為15.0%、32.5%，差異無統計學意義(P>0.05)；同時將Dys分為輕中度、重度不典型增生，CXCL10蛋白在兩種病理組織中差異無統計學意義(P>0.05)。分別將GC中CXCL10蛋白陽性和陰性病例的各臨床病理參數，包括性別、年齡、腫瘤分化程度進行統計分析， CXCL10蛋白在GC組中的表達與年齡無關，差異無統計學意義(P>0.05)；而在男性GC組中，CXCL10蛋白陽性表達率顯著高于女性，差異有統計學意義(P<0.05)；中低分化GC中CXCL10蛋白陽性表達率顯著高于高分化GC，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 CXCL10在CNAG、PL、GC病理組織中的陽性表達

3 討 論

趨化因子是一組結構同源，功能相似，且能趨化細胞定向移動的小分子分泌型蛋白。在趨化因子的分子中都有4個保守的半胱氨酸(C)，根據靠近分子氨基端(N端) 的前兩個C 間是否插入其他氨基酸,將他們分為CXC、C-C、C及CX3C四類亞族[6]，而CXCL10又稱為干擾素Y誘導蛋白10，屬于CXC類趨化因子，是1985年Luster等[7]首先發現并報道的能使細胞發生趨化運動的小分子細胞因子，其受體為CXCR3，含有2個亞群，即CXCR3A及CXCR3B。CXCR3B含有416個氨基酸，較CXCR3A在NH2-端的包外區長52個氨基酸殘基，此種結構的差異導致了CXCR3兩種亞群功能的顯著不同[8]。當CXCL10與其受體CXCR3結合，經GTP耦聯蛋白在機體炎癥、腫瘤、自身免疫等疾病中發揮重要的生理和病理效應。尤其在腫瘤形成的生物行為中發揮雙向作用：(1)通過抗腫瘤免疫性，抗腫瘤血管生成、誘導細胞凋亡從而起到抗腫瘤的作用；(2)通過促炎效應、促進腫瘤細胞增殖在腫瘤生成、發展的生物行為過程中發揮重要作用[9-10]。近年來，隨著CXCL10蛋白研究的不斷深入，CXCL10蛋白抗腫瘤機制日漸明朗，但亦有不少研究發現，高表達的CXCL10蛋白與大多惡性腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移相關，國內外已有大量文獻報道[1-2，11]，而在GC及其癌前病變中尚無CXCL10蛋白表達及臨床病理參數相關性的報道。

本研究采用免疫組織化學SP法和圖像分析定量，檢測了作為PL的CAG、IM、Dys這三類組織類型中CXCL10蛋白的表達情況，并同時檢測了其在CNAG中的表達情況。以期從腫瘤細胞自身的CXCL10蛋白表達水平方面解釋由PL發展為GC的可能機制。本研究結果顯示，CXCL10蛋白在CNAG、PL、GC三類病理組織中均有表達(陽性表達率分別為10.00%、26.67%、71.67%)，而在GC病理組織中的陽性表達率尤其升高,顯著高于PL及CNAG組；在PL、CNAG兩種病理組織中CXCL10 蛋白陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。同時研究顯示，CXCL10蛋白陽性表達率在CNAG-PL-GC過程中逐漸升高，尤其在GC階段,提示蛋白CXCL10有可能在胃黏膜的發育中起一定的作用，結果進一步佐證了PL發展成GC是一個逐漸演變的過程。并且CXCL10蛋白與腫瘤發生、發展機制在乳腺癌的研究中得以證實：在癌組織中，CXCL10與CXCR3A受體結合后，能在組織微環境中起作用，同時還能通過自主分泌的方式作用于腫瘤細胞本身，促進腫瘤細胞的生長，另一方面，當CXCL10蛋白與血管內皮細胞CXCR3B受體結合則抑制腫瘤細胞的生長。因此，當患者組織細胞CXCR3A受體占優勢，起保護作用的CXCR3B受體處于劣勢時，CXCL10蛋白與前者的優勢結合介導了腫瘤的發生、發展[9]。

本研究還將CXCL10蛋白表達與臨床病理參數統計分析，結果顯示，在GC組中男性CXCL10蛋白陽性表達率顯著高于女性，差異有統計學意義(P<0.05)，而與GC發病年齡無關。該結果再次證實我國男性發病率高于女性，而隨著生活及飲食習慣等影響，GC發病年齡越年輕化，各年齡階段均可見GC的發生，該結果提示臨床應該加強普查。同時中低分化GC組中CXCL10蛋白陽性表達率顯著高于高分化組，該結果提示CXCL10的表達可能與GC的分化類型相關，通過檢測不同分化類型CXCL10的表達在GC預后預測、個體化治療中可能具有一定的意義。此外，本研究還將PL按CAG是否伴腸化及是否伴異型增生分為兩個大組比較，發現CXCL10蛋白陽性表達水平在兩組病理組織中差異無統計學意義(P>0.05)，CXCL10蛋白的表達與CAG是否伴異型增生及腸化無關。同時將萎縮性胃炎伴不典型增生分為輕中度不典型增生及重度不典型增生，發現CXCL10蛋白的表達在輕中度、重度不典型增生的陽性表達率無明顯差異，說明CXCL10蛋白的表達與增生程度無關。

綜上所述，CXCL10蛋白與GC的發生、發展密切相關，且 CXCL10蛋白表達與GC的分化程度具有顯著相關性， CXCL10蛋白極有可能成為GC診斷預后標志物之一，同時利用分子生物學技術，阻斷CXCL10/CXCR3反應軸，可能成為GC治療的一個新靶點。

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