扣帶回前部NMDA受體與睡眠剝奪模型大鼠外周疼痛感受閾值的相關性研究

楊 宇劉 暢楊 雪高久壹張翠俠蘇道元

1.沈陽醫學院生理學教研室，遼寧沈陽 110034；2.沈陽醫學院臨床醫學系2012級學生，遼寧沈陽 110034

睡眠剝奪是指由于各種原因引起的睡眠缺乏導致機體疲勞及精神萎靡的癥狀。近年隨著人們生活節奏改變及工作壓力的增大，使得大部分人長期處于疲勞及睡眠缺乏狀態，導致近期睡眠剝奪患者的比例不斷增加[1]。研究發現，長期處于睡眠剝奪狀態的人們其容易出現多系統、多臟器損傷，導致機體出現各種疾病[2]。近年已有關于睡眠剝奪對神經中樞精神行為、認知能力相關影響的研究，但關于睡眠剝奪對機體疼痛感功能的影響的作用機制目前尚報道甚少[3]。研究認為[4]，中樞皮質扣帶回前部是痛覺調控及感受的關鍵部位，NMDA是神經信號傳遞過程中的重要物質。因此，本研究于2013年1月—2013年12月將通過建立睡眠剝奪大鼠模型，刺激并檢測大鼠足部痛閾，從而探討睡眠剝奪對機體痛覺神經的影響，為臨床防治疲勞應激引起的機體疼痛癥狀提供相關理論依據。

1 材料及方法

1.1 動物及分組

選取80只Wistar成年健康雄性大鼠 （由沈陽醫學院實驗動物中心提供），體重為（250±20）g，晝夜節律適應性飼養 1周，室溫控制在 （25±1）℃。隨機將大鼠分為正常組、睡眠剝奪24h組（A組）、睡眠剝奪48h組（B組）及睡眠剝奪72h組（C組），每組各20只Wistar大鼠。

1.2 大鼠睡眠剝奪模型的建立

采用小平臺水環境法制作大鼠模型，按照相關文獻制作30cm×30cm×30cm的箱子，往箱子中緩慢灌注水，水溫為20℃，水面與平臺距離為20cm,在平臺上放置食物及飲用水以供大鼠飲食。當大鼠睡眠時會由于肌肉緊張收縮而落入水中，同時在箱子中放置40W日光燈持續照射。實驗前先將大鼠放入箱子中圈養1周，讓大鼠適應新環境，防止環境應激性對大鼠產生影響。其中A組大鼠干預24h，B組大鼠干預48h，C組大鼠干預72h。對照組大鼠放在同樣體積的箱子中圈養，但箱子中不灌注水。

1.3 熱刺激大鼠足部實驗

采用由成都泰盟科技有限公司提供的型號為PL-200熱敏測試儀刺激大鼠足部，將大鼠放在透明的塑料籠中適應30min，待其安靜后采用熱敏測試儀照射大鼠足部，并記錄每組大鼠足部收縮反應時間，即熱刺激縮足潛伏時間。刺激時間為20s，每只大鼠測試時間間隔為45min，每只大鼠共測定3次取平均值。

1.4 Western bloting檢測

實驗組大鼠睡眠剝奪后，采用300mg/kg水合氯醛（廠家：鄭州優然食品化工有限公司，產品規格：25kg）將大鼠麻醉斷頭處死，將大鼠皮質扣帶回前部取出，并將其置于勻漿器中攪拌，每份組織中加入200μL細胞裂解液（廠家：南京森貝伽生物科技有限公司，型號規格：100mL,500mL），并將勻漿攪拌放入EP管中靜置30min，并在4℃環境中以1200r/min的速度離心處理 15min，留取上清液。采用由美國Pierce公司提供BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取40ug總蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜及封閉實驗，并加入由博士德公司提供的NR2A及NR2B抗體進行孵育震蕩過夜。次日將膜取出經TBS漂洗后加入美國Gell signaling公司提供的羊抗兔二抗于室溫下孵育1h，采用ECL發光法進行漂洗染色。同時采用Image 136b軟件測定蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.5 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件對結果進行分析，計量資料采用均數標準差（±s）表示，組間均值的比較采用t檢驗，進一步的兩兩比較采用LWISTAR﹣t法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

A組大鼠熱刺激足潛伏期為 （7.92±4.39）s與對照組 （8.02±3.12）s相比無統計學差異（P＞0.05)，而B組、C組大鼠熱刺激足潛伏期分別為（6.58±1.05）s和（5.12±0.96）s，B、C 組熱刺激足潛伏期顯著短于對照組及A組，差異有統計學意義（P＜0.05)。B組、C組大鼠腦組織中NR2A、NR2B表達水平顯著高于對照組及A組 ，差異有統計學意義（P＜0.05)，見表1。

表1 4組大鼠熱刺激足潛伏期及NR2A、NR2B表達水平分析（±s）

表1 4組大鼠熱刺激足潛伏期及NR2A、NR2B表達水平分析（±s）

注：A 組與對照組相比，aP ＞0.05；B組與 A組及對照組相比，bP＜0.05；C組與A組及對照組相比，cP＜0.05。

組別只數熱刺激足潛伏期（s）NR2A NR2B對照組A組B組C組F值P值20 20 20 20 8.02±3.12 7.92±4.39a 6.58±1.05b 5.12±0.96c 5.223 0.000 0.42±0.11 0.44±0.13a 0.62±0.18b 0.68±0.21c 4.963 0.002 0.52±0.14 0.53±0.15a 0.78±0.12b 0.81±0.14c 5.221 0.000

3 討論

馬雙雙等[5]發現，睡眠剝奪后可影響機體從而增加機體應激性反應，馬國亮等[6]研究發現，睡眠剝奪可導致軀體溫度痛覺閾值下降，從而影響感覺閾值。郭張華[7]等研究發現，睡眠可導致大鼠足部熱痛閾值下降，從而影響大鼠痛覺神經反應[5]。本研究通過建立大鼠睡眠剝奪模型從而觀察睡眠剝奪對大鼠機體的疼痛癥狀的影響，通過研究可知，睡眠剝奪24h組大鼠熱刺激足潛伏期為（7.92±4.39）s與對照組（8.02±3.12）s 相比無統計學差異（P＞0.05)，而睡眠剝奪48h組、睡眠剝奪72h組大鼠熱刺激足潛伏期分別為（6.58±1.05）s和（5.12±0.96）s，B、C 組熱刺激足潛伏期顯著短于對照組及A組，差異有統計學意義（P＜0.05)，從而表明機體外周疼痛感受可能與內臟痛覺感受調控上行傳導及下行抑制有關。

睡眠剝奪可影響神經細胞功能，從而影響神經系統可塑性及興奮性，導致神經系統認知功能受損。孔微微等[8]發現，中樞神經區域時痛覺調控及感受的主要區域之一，通過神經可塑性及興奮性可導致機體出現疼痛反應。相關研究認為[9]，神經系統痛覺興奮性的增加與NMDA表達水平上調有關。NR2A及NR2B是NMDA中的重要受體，其在神經痛覺傳導及感受中起到重要的作用。本研究中睡眠剝奪48h組、睡眠剝奪72h組大鼠腦組織中NR2A、NR2B表達水平顯著高于對照組及睡眠剝奪24h組 ，差異有統計學意義（P＜0.05)，從而表明MR2A及MR2B參與睡眠剝奪所致的外周痛覺神經傳導過程，具體作用機制還有待進一步研究。

[1]魏磊,高峻,吳文彬.前扣帶回NMDA受體NR2A亞單位與睡眠剝奪模型大鼠外周疼痛感受閾值的關系 [J].解放軍醫學雜志,2010,35(10):1235-1237.

[2]范新六,李峰,宋月晗.四慧合劑對疲勞模型大鼠學習記憶及海馬NMDA受體亞基NR2A、NR2B及EphB2受體表達的影響[J].中國中西醫結合雜志,2011,31(4):512-516.

[3]吳敏范，姚陽，李玉芳.貓雙側扣帶回前部內臟傷害感受神經元自發電活動特性的差異[J].生理學報，2010,62(5)：450-454.

[4]范新六,李峰,宋月晗，等.加味四逆散對睡眠剝奪大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體表達的調節作用[J].世界中醫藥,2012,07(3):261-262.

[5]馬雙雙,齊陽,王瑩,等.連續睡眠剝奪對大鼠認知能力、神經遞質及海馬結構的影響[J].海軍醫學雜志,2013,34(2):82-85.

[6]馬國亮,楊雪,董文芳，等.WSLP運載siRNA抑制炎性疼痛大鼠脊髓背角NMDA受體1基因表達的可行性 [J].實用醫學雜志,2013,29(18):2971-2973

[7]郭張華,陳建平.NMDA受體在神經病理性疼痛中作用的研究進展[J].中國疼痛醫學雜志,2013,19(3):173-176.

[8]孔微微,胡三覺,羅層，等.外周NMDA受體在慢性痛中的作用及機制研究[J].神經解剖學雜志,2011,27(3):340-343.

[9]陳肖龍.兩種脊髓損傷模型中NMDA受體NR2B亞基拮抗劑抑制神經病理痛[J].中國疼痛醫學雜志,2012,18(7):440.