川芎嗪對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響

杜麗娟 徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強 王明亮

川芎嗪對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響

杜麗娟 徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強 王明亮

目的 觀察川芎嗪對四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響, 探討川芎嗪治療肝纖維化的作用機制。 方法 四氯化碳皮下注射制備大鼠肝纖維化模型, 設立正常對照組、肝纖維化模型組和川芎嗪治療組, 川芎嗪治療組在造模過程中每天給予鹽酸川芎嗪注射液腹腔注射, 6周后, 乙醚麻醉, 腹主動脈采血, 產色基質偶氮法鱟試劑定量測定血漿內毒素；肝組織常規HE染色觀察肝臟病變, 天狼猩紅膠原染色、肝組織羥脯氨酸含量測定評測肝纖維化程度；West-blotting法檢測肝組織內Nrf2蛋白的表達, TBA法檢測肝組織丙二醛(MDA)水平, 酶顯色定量分析法檢測肝組織谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)含量。 結果 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比, 肝損傷較輕, 肝纖維化程度明顯降低, 血漿內毒素含量降低, Nrf2蛋白表達量增多, 肝組織中MDA含量降低, GST的含量升高。結論川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低內毒素血癥, 激活肝內Nrf2/ARE抗氧化通路進而使得抗氧化酶GST等含量增加有關。

肝纖維化；川芎嗪；抗氧化；Nrf2；內毒素

傳統中藥川芎為傘形科藁本屬植物, 味辛, 性溫, 歸肝、膽、心經, 氣香升散, 具有活血行氣, 祛風止痛的功效, 被前人譽為血中之氣藥。川芎嗪, 化學名2,3,5,6-四甲基吡嗪(TMP), 是從川芎的根莖中提取出的生物堿, 具有活血化瘀、抗血小板凝聚、改善微循環、擴張小動脈、抗氧化、抗組織器官纖維化等廣泛的藥理學作用。近年來的實驗研究表明,川芎嗪具有良好的抗肝纖維化作用, 可能與其抗脂質過氧化有關［1］, 但其具體作用機制尚不明確。本研究通過觀察川芎嗪對四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響, 進一步探討其防治肝纖維化的作用機制, 為臨床治療肝纖維化提供實驗依據。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料 雄性SD大鼠24只, 清潔級, 體重(200±20) g, 購自山西醫科大學動物中心, 普通飼料喂養, 自由進水。四氯化碳(CCl4)為中邦化工分析純；產色基質偶氮法鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；谷胱甘肽-S轉移酶(GST)、丙二醛(MDA)TBA法試盒購自南京建成生物工程研究所；羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP )標準品、天狼猩紅、固綠FCF購自Sigma公司；鹽酸川芎嗪注射液(鄭州卓峰制藥有限公司) ；兔抗NFE2抗體購自武漢博士德；小鼠抗β-actin、山羊抗小鼠IgG/HRP、山羊抗兔IgG/HRP抗體購自北京中杉金橋。

1. 2 動物分組及處理 將健康清潔級SD大鼠適應性喂養1周后, 隨機分為三組, A組(正常對照組)、B組(肝纖維化模型組)、C組(川芎嗪治療組)。A組不給予特殊處理, B、C組首次給予5 ml/kg體重CCl4分析純皮下注射, 然后按3 ml/kg體重皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液, 每周2次, C組于造模同時給予腹腔注射60 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液, 每周6次。6周后, 在乙醚麻醉無菌無熱源條件下, 腹主動脈采血取血漿測定血漿內毒素水平；取肝左葉一部分于4%多聚甲醛中固定, 24 h后流水沖洗、脫水、石蠟包埋, 行肝組織形態學檢測, 其余部分于-86℃ 保存用于下述指標檢測。1. 3 指標檢測及分析 石蠟包埋組織切片, 天狼猩紅膠原染色及常規HE染色。JD-801形態學圖像采集分析系統觀察分析, 計算肝組織的FI (纖維化指數, FI=纖維染色區面積/整個視野面積×100%)；肝組織HYP含量測定參照本實驗室以往改良的氯胺T法［2］；血漿內毒素及肝組織MDA、GST含量測定依照試劑盒說明書操作；Western-blotting檢測肝組織中Nrf2的表達量, 根據目的條帶與內參β-actin積分光密度比值行半定量分析。

1. 4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計分析軟件, 數據以(±s)表示, 行單因素方差分析(One-way ANOVA), LSD檢驗進行兩兩比較, 以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 形態學觀查 正常對照組肝組織結構清晰, 肝小葉結構正常, 膠原少, 主要分布在血管壁；肝纖維化模型組肝細胞變性, 肝竇及匯管區結構破壞, 膠原組織明顯增多；川芎嗪治療組肝細胞變性較肝纖維化模型組輕, 膠原形成較肝纖維化模型組少。

2. 2 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比血漿內毒素, 肝組織HYP、MDA和肝纖維化指數均降低, GST含量升高, Nrf2表達量增加(見表1)。

表1 各組大鼠血漿ET及肝組織HYP、MDA、GST、FI的變化( ±s)

表1 各組大鼠血漿ET及肝組織HYP、MDA、GST、FI的變化( ±s)

注：與正常對照組比較, aP<0.01, bP<0.05；與正常對照組比較, cP<0.01；與肝纖維化模型組比較, dP<0.01；與肝纖維化模型組比較, eP<0.05

組別 n ET HYP MDA GST FI Nrf2(Nrf2/β-actin)正常對照組 8 0.22±0.04 0.08±0.15 2.31±0.57 66.42±8.58 0.32±0.08 0.34±0.27肝纖維化模型組 8 0.78±0.29a 0.35±0.19a 14.86±2.11a 86.02±15.60a 5.25±0.56a 0.43±0.31b川芎嗪治療組 8 0.41±0.08bd 0.19±0.09cd 4.86±0.95cd 105.55±10.47cd 4.23±0.54ad 0.54±0.78be

3 討論

研究表明, 氧化應激與肝臟疾病的發生密切相關［3］。氧化應激主要通過啟動膜脂質過氧化改變生物膜功能、與生物大分子共價結合及破壞酶的活性等在細胞因子的共同作用下引起不同程度的肝損傷, 同時活化肝星狀細胞, 促進肝纖維化。所以抗氧化治療對防治肝臟疾病起著重要的作用［4,5］。

Nrf2(NF-E2-related factor 2)/ARE(antioxidant response element)是近年新發現的機體抵抗內外氧化和化學等刺激的防御性轉導通路．生理狀態下, Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結合使活性處于相對抑制狀態, 氧化應激作用下, Nrf2與Keap1解偶聯后轉移入核, 啟動ARE調控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達, 如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、血紅素氧合酶-1(HO-1)等, 從而增加細胞對氧化應激的抗性, 為肝臟疾病的發生發展起到積極的防護作用［4］。有研究發現, 在Nrf2敲除的小鼠中,正常情況和誘導情況下的Ⅱ相酶水平如谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、還原型輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)顯著減少［6］。在動物實驗和人群研究中發現, Nrf2與各種肝臟疾病的發生發展密切相關。近來研究表明, 一些藥物可激活Nrf2改善各種肝臟疾病。口服姜黃素可誘導Nrf2與ARE元件結合, 繼而啟動HO-1表達, 保護二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝損傷［7］。

近年來研究發現, 中藥川芎中的有效成分川芎嗪在治療肝纖維化中發揮了較好的治療效果。它可以抗肝細胞損傷和抗脂質過氧化, 抑制HSC的增殖與活化, 對肝纖維化形成起主要作用的信號通路如TGF-β、PDGF等信號通路的抑制,抑制肝細胞凋亡等, 從而有效發揮抗肝纖維化作用。實驗證明［8］, 川芎嗪能降低肝纖維化大鼠肝組織中丙二醛水平, 顯著減輕肝臟膠原纖維增生程度,防止和延緩實驗性肝纖維化作用。

本實驗通過川芎嗪干預CCl4誘導的大鼠肝纖維化, 檢測血漿內毒素含量, 肝組織中Nrf2、GST及MDA的含量, 進一步探討川芎嗪抗肝纖維化的作用機制。結果顯示, 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比, 肝纖維化程度減輕, 血漿內毒素內毒素含量減少, 肝組織Nrf2、GST含量增加, MDA含量減少, 提示川芎嗪抗肝纖維化機制還可能與降低腸源性內毒素血癥, 激活Nrf2/ARE抗氧化通路, 上調Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶表達有關, 從而為川芎嗪的臨床應用提供更加充實的實驗依據。

［1］ 馬進,鄭仕中, 陸茵,等.川芎嗪抑制肝纖維化作用機制的研究進展.中國臨床藥理學雜志, 2010(05):395-398.

［2］ 王登妮, 徐軍全, 宋維芳,等.黃芪對肝纖維化的防治作用.中國醫藥導報, 2010, 7(09):15-17.

［3］ Cederbaum A I, Lu Y, Wu D. Role of oxidative stress in alcoholinduced liver injury. Arch Toxicol, 2009, 83(6):519-548.

［4］ 胡勇, 張愛華. PKC-Nrf2/Keap1-ARE抗氧化通路與肝臟疾病.癌變·畸變·突變, 2012(02):151-153,156.

［5］ 王豫萍, 程明亮. Nrf2-Keap1抗氧化系統與肝臟疾病. 世界華人消化雜志, 2010, 18(18):1907-1911.

［6］ Iida, K., Itoh, K., Kumagai, Y.et al. Nrf2 is essential for the chemopreventive efficacy of oltipraz against urinary bladder carcinogenesis. Cancer Res, 2004, 64(18):6424-6431.

［7］ Farombi, E. O., Shrotriya, S., Na, H. K. et al. Curcumin attenuates dimethylnitrosamine-induced liver injury in rats through Nrf2-mediated induction of heme oxygenase-1. Food Chem Toxicol, 2008, 46(4):1279-1287.

［8］ 梁愛群. 川芎嗪的藥理及機理研究.時珍國醫國藥, 2005, 16(06): 532-533.

Effect of ligustrazine on Nrf2/ARE pathway in liver tissue of hepatic fibrosis rats induced by CCl4

DU Li-juan, XU Jun-quan, SONG Bin-Yu, et al. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Objective To explore the effect of ligustrazine on Nrf2/ARE pathway in liver tissue of hepatic fibrosis rats induced by CCl4 for studying the mechanism of its effect on hepatic fibrosis.MethodsHepatic fibrosis in rats was induced by carbon tetrachloride, rats were randomly divided into normal control group, hepatic fibrosis group and treatment group. treatment group rats were given ligustrazine intraperitoneally everyday while inducing hepatic fibrosis by carbon tetrachloride. After 6 weeks, rats were killed for collecting blood and liver tissues. Endotoxin in blood plasma was measured with a limulus amebocyte lysate test kit. The pathological changes of liver were observed by hematoxylin-eosin staining, the degree of liver fibrosis was assessed by stained of Sirius red for collgen and the contents of hydroxyproline in liver tissues. Nrf2 protein expression in liver tissues was detected by West-blotting method. The contents of malondialdehyde(MDA) in liver tissues were determined by TBA method, glutathione S-transferase(GST) by colorimetric enzymatic assay.ResultsFibrotic changes in liver of treatment group were ameliorated significantly compared with the hepatic fibrosis model group, and the content of plasma endotoxin were reduced, liver expression of Nrf2 was increased as well as GST, MDA was reduced accordingly.ConclusionThe protective effect of ligustrazine on liver fibrosis is possibly related to reducing endotoximia and activating Nrf2/ARE pathway in liver, thus increasing the content of antioxidant enzymes such as GST.

Hepatic fibrosis; Ligustrazine; Antioxidant; NF-E2-Related Factor 2; Endotoxin

030001 太原, 山西醫科大學(杜麗娟)；山西醫科大學汾陽學院(徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強 王明亮)

徐軍全 E-mail：xujq@ sina.com