標準曲線法測定土霉素片的抗生素效價

喬曉芳 楊景秀

（1 安陽市食品藥品檢驗所，河南 安陽 455000；2 林州市食品藥品檢驗所，河南 林州 456550）

衛生部抗生素分冊規定用抗生素微生物檢定法——管碟法（二劑量法[1]）測定其抗生素微生物活性（效價）[2]，本文利用抗生素微生物檢定法標準曲線法[3]測定其效價，效果較好，結果滿意。

1 實驗方法與結果

1.1 標準曲線制備

1.1.1 中間濃度的選擇：根據量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，在抗生素項下規定的劑量與反應線性范圍內選擇一個中間濃度C0＝13.5 U/mL。

1.1.2 標準溶液濃度的確定：依照標準品說明書的規定，臨用對照藥典規定稀釋，各劑量按等比級數稀釋。劑量間的距離為1∶0.85，算出中間劑量鄰近的高低2個濃度，C0+1及C0-1，再分別計算各劑量的濃度，各種濃度Cm（m1~m8）分別為7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 U/mL。

1.1.3 標準土霉素溶液的制備：精密稱取土霉素標準品，用滅菌水制成1000 U/mL，精密吸取20 mL至200 mL量瓶中，加磷酸緩沖液（pH7.8）稀釋成100 U/mL。再分別精密吸取3.5、7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 mL至100 mL容量瓶中，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，制成中間濃度為13.5 U/mL及Cm（m1~m8）各種濃度的標準溶液。

1.1.4 標準曲線的制定：取試驗用直徑約90 mm、高16~17 mm的培養皿24只，分為8組每組3只，每組各培養皿內間隔的3枚不銹鋼小管內分別滴滿標準品，Cm1~8，即8.4……21.0 U/mL溶液；另3枚不銹鋼小管內均滴滿標準品的中間濃度C0即13.5 U/mL溶液。在36 ℃培養14~16 h后，用游標卡尺逐一測量每個培養皿3個濃度的抑菌圈直徑。分別求得每組3個培養皿中間濃度C0所致的抑菌直徑平均值y0即C1~C8所致抑菌圈直徑的平均值，ym（即Cm＝1~8）。令fx＝ym-y0，分別計算測得值，則8組培養皿可得出f1~8的8個反應參數（表1）。以fm值為橫坐標，以相應的抗生素濃度對數為縱坐標，在方格紙上標點，將各點聯結即成標準曲線（圖1）；或經計算，得出回歸曲線直線方程式：Y＝0.15663X+1.32985，相關系數：r＝0.99878。

表1 土霉素標準曲線實驗數據

表2 兩法測定樣品的結果（n=4）

1.2 供試品效價測定

1.2.1 供試品效價測定：取標準品制備中間濃度的標準液，并取供試品，預估效價后，精取10 mL，加滅菌水制成每1 mL中約含1000 U的溶液，搖勻，靜置，精密量取上清液適量，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋到與標準品的中間濃度相同的供試液。取試驗用放置6枚不銹鋼小管的培養皿，一般不小于3個，在每一培養皿中，間隔的3枚不銹鋼小管中分別滴滿中間濃度的標準液，另3枚不銹鋼小管中滴滿供試液。在36 ℃培養14~16 h后，用游標卡尺測量各抑菌圈的直徑。分別求得標準液抑菌圈的直徑。分別求得標準液抑菌圈直徑平均值y。和供試液抑菌圈直徑的平均值ym，算出的差數（fm）。據此在標準曲線上讀取供試液的濃度，即可換算成供試品所含效價（U/mL），也可以代入回歸曲線直線方程式，算出供試品的效價（即含量）。

1.2.2 供試品效價的試驗比較：用標準曲線法測定土霉素片[2]批號分別為20101007、20111104、20120506、20121210，并與抗生素微生物檢定法（二劑量法）相比較，結果如下（表2）。

1.3 重復性試驗：取土霉素片（批號為20121210），按標準曲線法測定6份，其平均值為98.6%，RSD為1.40%。

2 討 論

標準曲線法測定土霉素片抗生素效價，選擇標準品中間濃度為13.5 U/mL，加菌液適量可現直徑在15~18 cm的菌圈，其抑菌圈較為清晰的邊緣。用標準曲線法測定效價與二劑量法相比較，結果沒有顯著差異，實驗過程雖然繁瑣，但結果準確，重現性好。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(二部)[M].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄93-95.

[2]國家藥典委員會.衛生部藥品標準,抗生素藥品第一冊[S].1989:89.

[3]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京:科學出版社,2001:231-234.