甲狀腺乳頭狀癌組織中雌激素受體亞型與表皮生長因子受體-2表達的關系

濮孟輝 金東嶺 王 蕾 鄭發著 時志民

(邯鄲市人民醫院外科，河北 邯鄲 056001)

已有研究表明〔1〕正常甲狀腺和甲狀腺癌的細胞內有雌激素受體(ER)α表達，而且對甲狀腺癌的發生和發展有促進作用。但對ERβ在腫瘤發展中的作用近來卻出現了一些有爭議的研究和報道〔2〕。最近發現〔3〕ERβ除了野生型之外有6種剪切變體：ERβ1～ERβ6，他們在某些腫瘤中的表達顯示了不同的生物學意義。除了ERβ1系野生型ERβ有較多的報道之外，一般認為ERβ2在腫瘤的發展過程中也有重要影響。前期研究〔4〕表明：在甲狀腺組織中ERβ2的表達較之ERβ1對甲狀腺濾泡上皮可能具有更為突出的保護作用。本研究旨在探討甲狀腺乳頭狀腺癌(PTC)組織中ERβ1、ERβ2以及ERα的mRNA表達及其與表皮生長因子受體(HER)-2的關系。

1 材料與方法

1.1研究材料 選取邯鄲市中心醫院、邯鄲市人民醫院等2010年3月至2011年2月間手術切除的PTC患者20例，均為女性，年齡(42.4±16.3)歲。術前均未行化療、放療及免疫治療。同時選取癌旁正常甲狀腺組織10例，年齡(38.1±8.4)歲。所有病例術后均經病理檢查證實診斷。每例標本取材后的標本迅速投入液氮中速凍，然后轉存于-70℃的冰箱。

1.2半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測ERβ1、 ERβ2和ERαmRNA的表達 兩步法RT-PCR 試劑盒和PCR 試劑購自Promega 公司;實驗中所有引物均由上海Sangon公司合成。RT-PCR按Trizolrna(Gibco公司)提取說明書對冰凍保存的甲狀腺標本進行總RNA抽提后，1 μg總RNA 用于逆轉錄合成cDNA，具體操作參照試劑盒說明進行。ERβ1和ERβ2引物序列參照文獻〔3，4〕，ERβ1：上游引物為：5′-CGA TGCTTTGGTTTGGGTGAT-3′， 下游引物為：5′-GCCCTCTTTGCTTTTACTGTC-3′；ERβ2：上游引物為：5′-TATTGACT GTTTGCGGCGACT-3′，下游引物為：5′-GGATGTTGATGTTTGACTGCT-3′；ERα上游引物：5′-TGCCAAGGAGACTCGCTA-3′ ，下游引物：5′-TCAACA，ITrCTCCCTCCTC-3′。內參照β-actin正向：5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，反向：5′-TCATCACCA1vrGGCAATGAG-3′。各取cDNA 3 μl 、ERβ1和ERβ2上下游引物各1 μl 、AMV逆轉錄酶(20 U/L)1 μl、1.5 mmol/ L MgCl2、1 ×PCR 反應緩沖液、0.2 mmol/L dNTPs 和滅菌水共同組成50 μl 的PCR 反應體系。94℃變性2 min后，按下述循環進行PCR擴增，ERα和β-actin，94℃變性45 s，55～C退火45 s，72～C延伸45 s；ERβ1、ERβ2反應條件:94 ℃45 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，共40 個循環。取10 μl PCR 反應產物行瓊脂糖凝膠電泳,結果進行光密度測定：用密度掃描儀(ZEISS全自動圖像分析儀，VIDAS數據分析)測定條帶的光密度值(A值)，分別用目的基因擴增產物與內參照基因擴增產物光密度比值表示每個樣品目的基因的表達水平。

1.3免疫組織化學染色 S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。甲狀腺組織石蠟包埋標本中HER-2表達采用S-P免疫組織化學染色，按試劑盒說明操作，用已知HER-2陽性的人乳腺導管浸潤癌標本作陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4免疫組織化學染色結果判斷 細胞質或細胞核存在棕黃色顆粒即定義為HER-2陽性細胞。表達水平判定：在光鏡下觀察，將每一張切片中棕黃色陽性細胞數>10%定義為HER-2表達陽性，陽性細胞數≤10%定義HER-2表達陰性。

1.5統計學分析 應用SPSS10.0統計軟件進行方差分析和獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1PTC組織中HER-2表達及ERα表達情況 PTC組HER-2陽性表達患者的ERα平均表達水平(n=14，0.582±0.371)明顯高于HER-2陰性表達患者(n=6，0.154±0.120)(t=2.728，P=0.013 8)。

2.2PTC組織中ERβ1與HER-2表達的關系 HER-2陽性表達患者的ERβ1平均表達水平(0.192±0.201)低于HER-2陰性表達患者(0.313±0.190)，但無統計學意義(t=1.252，P=0.226 5)。

2.3PTC組織中ERβ2與HER-2 表達的關系 HER-2陽性表達患者的ERβ2平均表達水平(0.118±0.091)明顯低于HER-2陰性表達患者(0.371±0.211)(t=3.828，P=0.001 2) 。

3 討 論

ERα和β亞型在雌激素敏感器官可對惡性腫瘤細胞的增殖發揮不同作用。前期研究〔5〕也曾對ERα在甲狀腺不同組織中的表達有初步探討。有關ERβ的生理病理作用，無論是在經典的雌激素靶組織還是在雌激素非依賴性組織，都存在著一些有爭議的問題〔2，3〕。Helguero等〔6〕對乳腺上皮細胞的研究表明，ERα可誘導17-β雌二醇導致的增殖，而ERβ對生長發揮抑制作用。近年來對ERβ在腫瘤發生發展中的作用尚存爭議，因為目前發現ERβ至少存在5種亞型(剪切變體)ERβ1～5，它們在腫瘤中的表達顯示不同的生物學意義。前期研究〔4，5〕表明ERα對甲狀腺濾泡上皮的增生和分化有促進作用，其過度表達與甲狀腺癌的發生發展有關系,而ERβ可能對甲狀腺濾泡上皮具有保護作用。ERβ1和ERβ2的表達缺失，尤其是ERβ2剪切變體的表達缺失可能使甲狀腺濾泡上皮細胞易受女性激素的影響，導致甲狀腺濾泡上皮細胞的增生致癌變。生長因子激活的受體酪氨酸激酶傳導通路與細胞的增殖關系密切〔7〕，在激素依賴性腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。本實驗提示PTC患者中ER亞型的表達可能受HER-2 調節。即HER-2，上調ERα和(或)下調ERβ1和ERβ2，促進腫瘤進展。進一步說明在甲狀腺組織中保持正常的ERβ2表達水平較之ERβ1對甲狀腺濾泡上皮可能具有更突出的保護作用，其表達下調與甲狀腺腫瘤的發生、發展和轉移有密切關系，并且是一個強有力的預后評估指標，可以為早期診斷、判斷預后及指導治療提供理論依據。

4 參考文獻

1Lewy-Trenda I. Estrogen and progesterone receptors in neoplastic and non-neoplastic thyroid lesions〔J〕.Pol J Pathol，2002；53(2):67-72.

2Skliris GP，Munot K，Bell SM,etal.Reduced expression of estrogen receptor beta in invasive breast cancer and its re-expression using DNA methyl transferase inhibitors in a cell line model〔J〕.J Pathol，2003；201(2)：213-20.

3Green CA，Peter MB，Speirs V，etal.The potential role of ER beta isoforms in the clinical management of breast cancer〔J〕.Histopathology，2008；53(4)：374-80.

4金東嶺，王 蕾，席 豐，等.甲狀腺腫瘤組織中雌激素受體β1和β2的表達及其意義〔J〕.中華內分泌代謝雜志，2011；27(11)：932-4.

5金東嶺，李聯祥，劉現軍，等.雌激素受體亞型ERα、ERβ和Ki-67在不同甲狀腺疾病組織的表達及意義〔J〕.解放軍醫學雜志，2008；33(9):1109-12.

6Helguero LA，Faulds MH,Gustafsson JA，etal.Estrogen receptors alfa (ERa) and beta (ERβ)differentially regulate proliferation and apoptosis of the normal murine mammary epithelial cell line HC11〔J〕.Oncogene，2005；24(44)：6605-16.

7Rony S，Edwin GK.The MAPK signaling cascade〔J〕.FASEB J，1995；9(9):726-35.