腫瘤壞死因子-α在膿毒癥大鼠心肌損害中的表達(dá)及作用機(jī)制

張文偉 魏 威 曹 紅 金 輝

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

膿毒癥病情發(fā)展異常迅猛，易快速進(jìn)展為嚴(yán)重的膿毒血癥，甚至感染性休克，研究表明心肌抑制和對(duì)兒茶酚胺耐藥的低血壓是嚴(yán)重膿毒血癥的兩種主要死亡原因〔1〕。一旦出現(xiàn)心肌抑制導(dǎo)致的心肌損害，患者的心肌功能會(huì)持續(xù)惡化，其病死率可上升至60%～90%。本研究觀察腫瘤壞死因子(TNF)-α在盲腸結(jié)扎穿孔法制造膿毒癥大鼠心肌中的表達(dá)強(qiáng)度及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立及分組 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(123±12)g，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)、膿毒癥組(20只)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均可自由飲水，但要禁食12 h，膿毒癥組參照并改進(jìn)陳輝等〔2，3〕的方法進(jìn)行造模，按300 mg/kg應(yīng)用10%的水合氯醛注射于腹腔內(nèi)麻醉后將大鼠固定于簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)上，腹部備皮，消毒鋪巾后沿腹正中線作長(zhǎng)約2 cm的切口，探查并找到盲腸，將盲腸內(nèi)的糞便輕輕向遠(yuǎn)端擠，于距離回盲端60%處用4號(hào)線環(huán)形結(jié)扎盲腸，用20 ml注射器針頭穿透盲腸，擠出少量糞便，并留置細(xì)橡皮條貫通盲腸防止針道閉合，還納盲腸回腹腔，逐層關(guān)閉切口，術(shù)后按30 ml/kg給予股部皮下注射9%氯化鈉預(yù)防休克發(fā)生，術(shù)后常規(guī)進(jìn)水。對(duì)照組僅開(kāi)腹翻動(dòng)盲腸。

1.2取材及標(biāo)本處理 在造模術(shù)后20 h，所有大鼠以麻醉法處死后立即取出心臟，生理鹽水沖洗后，切取心尖部分(包含部分室間隔前部與左心室心肌約100 mg)，置入4%的甲醛中固定72 h，脫水、石蠟包埋、病理切片、HE和免疫組化染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。

1.3膿毒癥所致心肌損害的病理分級(jí) 參照Rone評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔4〕將心肌損害的病理改變分為0級(jí)：無(wú)病變；Ⅰ級(jí)：心內(nèi)膜下小局灶性病變；Ⅱ級(jí)：心肌大范圍的灶性病變，心肌纖維出現(xiàn)腫脹斷裂；Ⅲ級(jí)：心肌內(nèi)廣泛的融合性病變；Ⅳ級(jí)：心肌出現(xiàn)壞死、變性。

1.4電鏡觀察心肌切片白細(xì)胞浸潤(rùn)程度分級(jí)〔5〕按電鏡高倍視野下所見(jiàn)目測(cè)評(píng)估，0級(jí)：間質(zhì)間無(wú)白細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ級(jí)：間質(zhì)間有極少量白細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅱ級(jí)：間質(zhì)間有少量白細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅲ級(jí)：間質(zhì)間有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.5TNF-α表達(dá)強(qiáng)度染色結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)〔6〕SP試劑盒及抗TNF-α單抗均由廣東中山生物科技有限公司生產(chǎn)。心肌細(xì)胞中TNF-α染色為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色，而細(xì)胞核不著色。按照染色的強(qiáng)度分為：①?gòu)?qiáng)陽(yáng)性() 呈棕黃色：②陽(yáng)性()呈黃色；③弱陽(yáng)性(+)呈淺黃色：④陰性(-)不著色。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法的Ridit分析。

2 結(jié) 果

2.1電鏡下觀察心肌損害程度對(duì)比結(jié)果 術(shù)后膿毒癥組大鼠一般情況逐漸惡化，表現(xiàn)為嗜睡、精神萎靡、活動(dòng)減少、刺激反應(yīng)低、寒戰(zhàn)甚至腹瀉、豎毛、呼吸急促，剖腹探查見(jiàn)惡臭、血性腹水、盲腸結(jié)扎穿刺處腫脹顏色變黑，粘連并出現(xiàn)壞疽，小腸腸管擴(kuò)張充血、腸脹氣，肝、腎充血水腫；提示造模成功。對(duì)照組心肌病理切片電鏡下觀察見(jiàn)心肌纖維束形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，閏盤(pán)顯示清晰，所見(jiàn)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)異常，心肌間質(zhì)未見(jiàn)充血、水腫，無(wú)炎性細(xì)胞，Rone病理分級(jí)均為0級(jí)：無(wú)病損。膿毒癥組可見(jiàn)心肌纖維廣泛的斷裂、纖維束結(jié)構(gòu)排列紊亂，可見(jiàn)心肌細(xì)胞腫脹、空泡變性、皺縮；心肌間質(zhì)充血、水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。膿毒癥組心肌Rone病理分級(jí)(心肌損傷程度Ⅱ級(jí)4只、Ⅲ級(jí)10只、Ⅳ級(jí)6只)及白細(xì)胞浸潤(rùn)程度(Ⅱ級(jí)2只，Ⅲ級(jí)18只)均明顯高于對(duì)照組(均為0級(jí)20只)(P=0.007 20、0.000 12)。

2.2TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度免疫組化染色結(jié)果 膿毒癥組TNF-α表達(dá)強(qiáng)度(6只、14只)明顯強(qiáng)于對(duì)照組(-19只，+1只)(P=0.002 9)。

2.3膿毒癥組心肌中TNF-α表達(dá)的強(qiáng)度與病理分級(jí)及白細(xì)胞浸潤(rùn)程度的關(guān)系 病理Ⅳ級(jí)，TNF-α表達(dá)呈，白細(xì)胞浸潤(rùn)程度為Ⅲ級(jí)>病理Ⅲ級(jí)，TNF-α表達(dá)呈～，白細(xì)胞浸潤(rùn)程度為Ⅱ～Ⅲ級(jí)>病理Ⅰ～Ⅱ級(jí)，TNF-α表達(dá)呈，白細(xì)胞浸潤(rùn)程度為Ⅰ級(jí)>病理0級(jí)，TNF-α表達(dá)呈-或+，白細(xì)胞浸潤(rùn)程度0級(jí)，心肌TNF-α表達(dá)強(qiáng)度與心肌的損傷程度、心肌白細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。

3 討 論

盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)建立的膿毒癥模型，已廣泛用于膿毒癥的研究。臨床上發(fā)現(xiàn)近70%的膿毒癥患者會(huì)并發(fā)心肌損害 (在新生兒敗血癥中尤其常見(jiàn)，其心肌損害的發(fā)病率及病死率均較高)，一般認(rèn)為于膿毒癥發(fā)生后5 h就存在心肌損傷，可稱之為早發(fā)型，此型最初是心臟自身功能障礙，而心肌形態(tài)學(xué)正常，表現(xiàn)為可逆的動(dòng)力學(xué)障礙，即血壓在正常范圍內(nèi)出現(xiàn)心肌收縮功能抑制，這常演變?yōu)殡y治性休克的前兆，心肌損害發(fā)生的越早，病情就越重，病死率也越高；膿毒癥休克時(shí)出現(xiàn)的心肌損害稱為晚發(fā)型(即低血流動(dòng)力期型)，易控制，預(yù)后較早發(fā)型好〔7〕。膿毒癥發(fā)生心肌損害的概率非常高，臨床一旦懷疑膿毒癥，應(yīng)及早采取有效措施預(yù)防或減輕心肌損害。

目前研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)在膿毒癥心肌損害的發(fā)生機(jī)制中占主導(dǎo)地位〔8〕。膿毒癥主要由革蘭陰性菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)進(jìn)入血液導(dǎo)致，LPS黏附于單核-巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的表面，與細(xì)胞膜上的TLR4-MD2/CD14復(fù)合體結(jié)合，結(jié)合體將LPS承載的信號(hào)傳入心肌細(xì)胞內(nèi)，從而引起TNF-α等炎癥介質(zhì)釋放〔9〕。心肌組織產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子用來(lái)抵抗致病物質(zhì)的侵襲，如果產(chǎn)生過(guò)量，反而會(huì)加重膿毒癥患者的心肌損害〔10〕。目前普遍認(rèn)為心肌組織及循環(huán)中產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子在膿毒癥的心肌損害病理變化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，尤其體現(xiàn)在早發(fā)型心肌損害中〔11〕。

TNF-α在膿毒癥心肌損害中的作用機(jī)制，目前為止尚無(wú)確切定論，可能與下述兩種因素相關(guān)：①趨化并激活白細(xì)胞〔12〕。TNF-α作為一種炎癥因子可引起白細(xì)胞趨化、集聚，同時(shí)釋放化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致組織損害，TNF-α首先作用于損害部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞，將其表面的白細(xì)胞黏附趨化因子激活，這種因子會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集并黏附于損傷的心肌細(xì)胞上，白細(xì)胞釋放出一系列化學(xué)物質(zhì)從而導(dǎo)致心肌組織損傷。②通過(guò)壞死方式來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。研究〔13〕證實(shí)人心肌細(xì)胞的表面擁有可表達(dá)TNF的特異性受體TNF-R1、R2的受體蛋白和mRNA，說(shuō)明TNF-α可直接與心肌細(xì)胞膜的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其抑制效應(yīng)，從而抑制心肌收縮功能或直接損害心肌組織。

本研究印證了膿毒癥心肌損害確與TNF-α有密切的關(guān)系，呈正相關(guān)性，也就是說(shuō)心肌損害越重，心肌中TNF-α表達(dá)越強(qiáng)，反之亦然。TNF-α的表達(dá)與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥心肌損害的重要機(jī)制之一。及早干預(yù)阻斷炎癥傳導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)治療膿毒癥心肌損害及降低病死率至關(guān)重要。

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