比較恒溫培養箱和原位雜交儀在EBER原位雜交中的應用

陳永欽 鄭宇輝 楊映紅

比較恒溫培養箱和原位雜交儀在EBER原位雜交中的應用

陳永欽 鄭宇輝 楊映紅

EBER；原位雜交儀；恒溫培養箱；原位雜交

EBER是EB 病毒編碼的小RNA, 是該病毒的表達產物,在被感染的細胞核中以高拷貝數存在。許多腫瘤性疾病與其感染密切相關, 例如鼻咽癌、NK/T 細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤樣癌等。近年來, 臨床病理診斷越來越依賴原位雜交技術檢測病毒是否存在, 但是實驗過程耗時較長,涉及不同工作溫度。目前大多商品試劑盒的主要設備是恒溫培養箱, 而利用原位雜交儀尚未普及。本文根據該技術的操作特點, 將原位雜交儀的操作程序優化后用于該技術并將其應用效果與恒溫培養箱作比較。

1 材料與方法

1.1材料 來自福建醫科大學附屬協和醫院病理科, 并且已經明確診斷。其中鼻咽癌3例, NK/T 細胞淋巴瘤9例、霍奇金淋巴瘤2例、 淋巴上皮樣癌6例。每例切片 2 張, 厚度3 μm, 然后隨機抽取, 將兩張切片分別標記為手工組和儀器組。手工組的變性雜交操作在恒溫培養箱進行, 儀器組在原位雜交儀上進行, 其余步驟一致。

1.2主要試劑和儀器 組織細胞原位雜交試劑盒(福建泰普生物科學有限公司)；Statspin Thermo Brite 原位雜交儀；DNP-9052型電熱恒溫培養箱。

1.3方法 兩組切片的前期處理相同, 常規烤片脫蠟, 水化,甩干切片, 將組織周圍液體用濾紙吸干, 然后滴加適量蛋白酶 K( 與PBS 按 1:25 的比例混勻, 現用現配) 室溫消化5 min,蒸餾水洗滌, 無水乙醇干燥, 用標記筆在組織周圍畫圈。然后滴加適量探針雜交液, 手工組將玻片放入濕盒用恒溫培養箱55℃ 孵育80 min, 結束后調整溫度, 待溫度降至 37℃ , 雜交過夜, 而儀器組直接在原位雜交儀上, 運行已設定好的程序即55℃ 孵育80 min, 然后 37℃ 雜交過夜。儀器自動運行。之后PBS 沖洗, 滴加 EBER 一抗(A液)、B 液, C液, 分別孵育30、20、30 min, 每個步驟后均用 PBS 沖洗3次, 3 min/次。最后進行 DAB顯色和常規蘇木素復染、封片。

1.4判讀標準 雜交陽性信號位于細胞核內, 呈棕褐色。

2 結果

在顯微鏡下觀察實驗結果, 通過比較可以看出：手工組20張切片均觀察到陽性信號位于細胞核中, 為棕褐色, 呈深染, 容易辨認, 非特異性背景少。儀器組20張也均呈陽性,鏡下效果與手工組相似。

3 討論

根據原位雜交原理, 應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對原則進行特異性結合而形成雜交體, 再利用與標記物相應的檢測系統進行顯示處理, 從而達到檢測目的。這一技術具有很高的敏感性和特異性。Khan［1］認為, 原位雜交技術是組織學材料中檢測 EB病毒的金標準, 在檢測時具有定位作用, 能夠確定病毒與組織和細胞的關系。在確定與疾病的關系時, 原位雜交已成為公認的標準方法［2］。雖然此技術過程比較繁瑣,但與蛋白水平檢測相比, 具有明顯的優越性, 其關鍵步驟在于變性雜交過程。在整個實驗過程中, 利用恒溫培養箱進行變性雜交可以看出:在55℃ 孵育結束后, 需要人為二次設定溫度并且只有等到溫度降到37 ℃之后才能進一步操作, 這過程需要消耗一定時間。而利用原位雜交儀, 事先設定好程序, 儀器可以在55℃ 孵育結束后自動降至37℃, 降溫快, 不需要人為二次設定溫度。所以, 經過比較作者認為, 恒溫培養箱雖然作為病理科技術室的重要設備, 其成本低, 應用范圍廣, 已在基層醫院普及, 但在進行EBER原位雜交時, 利用恒溫培養箱人工操作步驟較多, 周圍環境溫度等條件也容易影響操作過程, 延長整個實驗的時間, 進而可能影響結果,導致重復性不夠理想。而原位雜交儀雖然儀器成本較高, 不易在基層醫院普及, 但操作簡單, 程序靈活多變, 結果穩定,重復性好, 應作為首選設備。

參考文獻

［1］ Khan G.Screening for Epstein- Barr virus in Hodgkin’ s lymphoma.Methods Mol Biol, 2009(511):311-322.

［2］ 周小鴿, 張小平, 張勁松.EB 病毒及其相關疾病.診斷病理學雜志, 2001, 8(1):58-59.

2014-05-13］

350001 福建醫科大學附屬協和醫院病理科